生体内イオン濃度の測定のための蛍光ナノ粒子

本実験の目的は、in vitroおよびin vivoアプリケーション向けのナトリウムナノセンサーを作製することです。これは、ナノセンサーの構成成分を含むオプト混合液を調製することで達成されます。第2ステップとして、界面活性剤を水溶液中で超音波処理して均一に分散させ、そこにオプトを加えることでナノセンサーを形成させます。

次に、超音波処理を行いながら、オプト混合物を水性界面活性剤混合物に添加し、溶液中でナノセンサーを形成させます。このビデオでは、センサーの応答が調整可能であることを実証しています。これらのセンサーは心筋細胞にマイクロインジェクションすることができ、また、マウスの皮下へ注入することも可能です。

蛍光指示薬などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、生理的環境に適合するダイナミックレンジにセンサーを調整でき、より広範囲のアナライトを測定し、定量分析のためのレシオメトリック測定が行えることです。一般的に、この方法に不慣れな方は、センサー作製後にそれを生物学的環境に導入することに困難を感じる場合があります。オプトセンサーを作製する前に、記載されたプロトコルに従って、乾燥ナトリウムイオン four x、乾燥ナトリウム TFPB、および chromo four three のストック溶液を準備しておく必要があります。

ドラフトチャンバー内で、すべての材料を1.5 milliliterのガラスバイアルに合わせます。テフロンコーティングのスクリューキャップを締め、すべてのPVCが溶解するまでバイアルを穏やかにボルテックスします。溶液は赤色になります。

4 gのガラスバイアルに10 mg/mLのPEG脂質を100 µL加え、ナノセンサーの作製を開始します。次に、10 mM HEPESなどの目的の水溶液を4 mL加えます。

ラボジャックを使用して、超音波処理チップをバイアル内に7 mmまで浸し、低出力で30秒間ソニケーションを行います。0.6 mLチューブに、オプト材料50 µLとジクロロメタン50 µLをピペットで加え、均一に混合させます。次に、3分間のソニケーションを開始します。

ソニケーションを開始すると同時に、ピペットチップを浸し、100 µLのopto混合液を一度に素早く均一に注入します。pHが7を超えた場合、および溶液から残留THFとジクロロメタンを除去するためのナトリウムが存在しない場合、溶液は青色に変化します。ソニケーションチップを2 mmの深さに移動させます。

残り3分が経過すると、溶液は不透明になります。超音波処理が完了したら、ナノセンサー溶液を5 mLシリンジで吸い上げます。フィルターを取り付け、ナノセンサー溶液をねじ蓋付きのガラスバイアルに分注します。

まず、ナノセンサーの感度を測定するための、ナトリウム濃度を段階的に上げた10種類の溶液を調製します。0 Mおよび1 Mのナトリウムストック溶液を50 mLコニカルチューブ内で混合します。次に、光学底96ウェルプレートの1列にある3つのウェルに、各濃度のナトリウム溶液を100 µLずつ分注します。

次に、調製したばかりのナノセンサーを各ウェルに 100 µL ずつ加え、プレートをマイクロプレートフルオリメーターにセットし、使用するクロモフォアに最適な励起波長、蛍光波長、およびカットオフ波長を入力します。測定波長の選択はアプリケーションによって異なります。これらの波長により、細胞内での高速ダイナミクスの測定やノイズの低減が可能になります。

α値を求めるには、570 nmにおける強度の値を670 nmまたは680 nmにおける強度で除します。α値をナトリウム濃度の対数に対してプロットしてください。なお、ナトリウム濃度0の対数は−1と設定します。

次に、応答にシグモイド曲線を当てはめ、その曲線からα値が0.5となるナトリウム濃度を算出します。これは、センサーが最適に応答するナトリウム濃度を表します。この情報を用いて、optoにおけるsodium iono four x sodium TFPBとchromo iono four threeの比率を調整し、最適なナトリウム濃度を持つナノセンサーを作製します。

例えば、異なる光学的製剤を代表する5つの異なるナノセンサーセットの応答曲線で、ナトリウム量のみを4つの10で変化させたものなどがあります。細胞内イメージングを行う場合は、細胞培地をTyro溶液などの透明な培地に置き換え、細胞をイメージングチャンバーに移します。次に、引き伸ばしたガラスピペットに、水に5 mg/mLのグルコースを溶かして調製したナノセンサー溶液をバックフィルします。

次に、ピペットをマイクロマニピュレーターに取り付け、圧力制御注入システムに接続します。ピペットを細胞の上に下ろし、細胞質内に挿入します。膜を貫通させるために、マニピュレーターホルダーを軽く叩く必要がある場合があります。

数百picolitersのナノセンサー溶液を注入し、速やかにピペットを回収します。麻酔チャンバーを用いて、isof fluorineでCD-1ヌードマウスを麻酔します。麻酔後、マウスを消毒済みのイメージングチャンバーに配置します。

次に、滅菌済みの31Gインスリン用注射器に、10 mM PBSで調製し適切なKD値を持つナノセンサーを 10 µL 分充填します。ピンセットを使用して、すべての気泡を取り除いてください。マウスの目的の注射部位で、皮膚を軽くつまみ上げて保持します。

針先を上に向け、皮膚と平行にシリンジを刺入します。次に、シリンジのプランジャーを後方に引き、針が血管に入っていないことを確認します。背圧を最小限に抑えるため、針を左右にゆっくりと動かし、皮膚内にポケットを作ります。

次にセンサーを注入し、ゆっくりとシリンジを抜きます。注入部位を軽く圧迫し、注入部位から漏れ出した溶液を拭き取ります。通常、背沿いに等間隔で6か所の注入を行います。

異なるマウスで実施する場合は、病気の伝播および交叉汚染を最小限に抑えるため、針を交換してください。注入後、ナノセンサーの励起・蛍光スペクトルに密接に適合するフィルターセットを用いて、明視野像および蛍光像を取得します。これにより、皮膚の自家蛍光も最小限に抑えられます。

これらの新生児心筋細胞はカバーガラス上で培養され、ナトリウムナノセンサーが注入されました。この蛍光画像は639ナノメートルの励起波長で撮影されたものです。こちらは同じ細胞の明視野画像であり、最後にその2つの画像を重ね合わせたオーバーレイ画像を示します。

一部にセンサーの凝集が見られますが、細胞の形態は正常です。センサーは細胞質全体に拡散しており、核への集積は見られません。この明視野像と蛍光像の重ね合わせ画像は、ヌードマウスの皮下組織にナトリウムナノセンサーを9箇所に分けて皮下注射した様子を示しています。

適切に実施すれば、Mastenのナノセンサーの作製は数分で完了し、可逆的なリアルタイムのアナライト変動を測定するあらゆる研究に応用可能です。このビデオを視聴することで、生物学的環境における定量測定のために、ナノセンサーを細胞内または皮下空間に導入する方法について十分に理解できるはずです。