Name: 生体内イオン濃度の測定のための蛍光ナノ粒子 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学ぶ 蛍光ナノ粒子を用いたナトリウムナノセンサーの作製法。心筋細胞へのマイクロインジェクションやマウス皮下投与による生体内イオン濃度測定技術を習得し、生理学的環境に適した定量分析を実現します。

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JMDとMKBは、ノースイースタン大学（NCIとNSFの助成DGE - 0504331からの資金）でIGERTのナノメディシンの科学技術プログラムを通じて資金が賄われています。この作品は、一般医科学グラントR01 GM084366の健康国立研究所の国立研究所によって資金を供給された。我々はまた、動物のプロトコルの開発における彼の貢献のために心筋細胞とケビンの現金を提供するためにボストンでBIDMCのSaumyaダスとアンソニーローゼンツヴァイに感謝。

1。 optodeの準備 optodeを行う前に、コンポーネントのアリコートは、それらが容易に測定し、保存することができるよう、必要です。 <ol><li> 50 mgのナトリウムイオノX（NaIX）バイアル、50 mgのナトリウムテトラキス[3,5 - ビス（トリフルオロメチル）フェニル]ホウ酸（NaTFPB）各tetrahyrdofuran（THF）で育ったと1.5 mlのポリスチレン遠心管に分注しされます。化学煙フードでは、出荷のバイアルにTHF 1mlにNaIXの50 mgを溶解し、固体が完全に溶解していることを確認するために混ぜる。 10個の分離した遠心チューブにこの溶液100μlを移す。 NaTFPBについて繰り返します。 THFは、一晩化学ドラフト内で蒸発させる遠心チューブにラベルを付けたり、保管のための4度の冷蔵庫でそれらを配置することができます。これは、乾燥NaIXとNaTFPBの5mgのアリコートを作成します。 </li><li> THF 1mlにChromoionophore III（CHIII）を溶解し、3 mlのガラスバイアルに移す。任意の残留CHIIIを溶解し、3 mlのガラスバイアルにこれを追加するCHIIIの出荷のバイアルにTHFの別の1 mlの。現在2 mlの合計があるでしょう。テフロンコーティングされたキャップを持つ2つの別々の1.5 mlガラスバイアルにTHF溶液中でCHIIIの1 mlを入れる。 5 mg / mlの最終濃度で4度の冷蔵庫でCHIIIソリューションを保管してください。 </li></ol>これらのアリコートとソリューションはoptode材料を作るために使用されます。 <ol start="3"><li>ピペットテフロンコーティングスクリューキャップ付1.5 mlのガラスバイアルにビス（2 - エチルヘキシル）セバケート（DOS）の66μlを - これはoptodeバイアルです。 DOSは、粘性の溶液ですので、バイアルに移しているソリューションの適切な量を確保するよう注意しなければならない。ボリュームは、DOSの約60 mgに対応しています。 </li><li>高分子量ポリ（ビニル）塩化ビニル（PVC）の30 mgを秤量し、optodeバイアルにこれを転送する。 </li><li>今必要なoptodeを作成するoptodeバイアルに分注し、機能コンポーネントを追加します。 CHIII、NaIX、およびNaTFPBの相対濃度は、ナトリウムに対するセンサーの応答を決定します。これらの濃度は、理想的には150mMのKdを、10mMの、または細胞外濃度のKdで、濃度を細胞内に応答するセンサーを持つように調整することができます。さらに、おそらく正しい応答が化学成分のそれぞれの新しいバッチのために発生しているかどうかを判断するために必要なセンサーのベンダーとキャリブレーションから、化学薬品のバッチ変動へのバッチがあるでしょう。ここでは、通常、細胞内のナトリウムの測定に使用される濃度とセンサーを作成する方法を説明します。 </li><li>化学煙フードでは、optodeバイアルへのTHF溶液に5 mg / mlのCHIIIの100μlを移す。 </li><li> THF 300μlでNaIXの5mgを溶解し、NaIXの5mgにこの相関、optodeバイアルに300μlを移す。 </li><li> THF500μlにNaTFPBの5mgのアリコートを溶解し、NaTFPB 0.1mgのにoptodeバイアル、この相関に溶液20μlを転送する。 </li><li> optodeバイアルにTHFの80μlを添加する。 </li><li> optodeバイアル内の溶液は、塩ビ、DOSの60mgの、NaIX、NaTFPB、THF500μlのでCHIIIのは0.5mg 0.2mgの5 mgの30 mgを含んでいます。穏やかにボルテックスこのバイアルは、PVCのすべてになるまで溶解した。 optodeは赤い色になります。バイアルに加えTHFの合計金額に関係なく使用されるコンポーネントの割合の500μLにする必要があります。 </li><li> NaIXとNaTFPBアリコートの残りのTHFが化学物質の適切な量で一晩、再ラベル管を蒸発させる。 </li></ol> 2。ナノセンサーを作成する<ol><li> 10ピペット100μlのmg / mlの1,2 -ジステアロイル- sn -グリセロ-3 -ホスホエタノールアミン- N - 4ドラムのガラスバイアルにクロロホルムで[メトキシ（ポリエチレングリコール）-550]（PEG脂質）。クロロホルムは化学ドラフト内で蒸発させる。このプロセスは、窒素ガスや家の空気を持つソリューションを乾燥させることにより迅速なすることができます。 </li><li> PEG -脂質とのバイアルに、目的の水溶液4mlを追加します。超音波処理の先端の下に研究室ジャックにバイアルを置き、先端が30秒間の低超音波の力で解決し、超音波処理の深さ7ミリメートル程度になるまで、バイアルを上げる。ここでは、½インチの先端径のステップ角で15％の振幅に設定さブランソンデジタル超音波処理を使用してください。水溶液は、すべてのソリューションにすることができます。例えば、我々はtrizmaベースと10mMのHEPES緩衝液pH 7.2を使用するセンサーの応答を決定する。 </li><li>ソリューションを超音波処理されている間、0.6 mlのマイクロ遠心チューブにジクロロメタン50μlとoptode材料の50μlを混合する。さらにミキシングを確保するために、ピペットで混ぜる。 </li><li> 3分間超音波処理する超音波処理のコントロールを調整します。超音波処理を起動し、超音波処理しながら溶液中にピペットチップを浸漬し、手っ取り早い、さらに注射で溶液100μlを分注してバイアルにoptode混合溶液を加える。解決策は、青、depeを有効にしてください使用される水溶液にnding。 </li><li>超音波処理は、その後約30秒間継続する超音波処理チップが溶液中で深さ約2mmになるようにジャッキを下げることができます。これにより、ソリューションを曝気を開始する必要がありますし、解決策が不透明になります。このステップでは、液から残留THF、ジクロロメタンを除去するのに役立ちます。 </li><li>超音波処理が完了すると、5mlシリンジにナノセンサーソリューションを引き上げます。 0.2μmのシリンジフィルターを取り付け、スクリュートップキャップ付きガラスバイアルにナノセンサーソリューションを分注する。 10mm未満のナトリウムが含まれており、約9未満のpHを有する水溶液が使用されている場合、溶液は透明とブルーになります。そうでなければ、それは色がないかピンクにする必要があります。 </li></ol> 3。 nanonsensor応答の決定このメソッドは、細胞内のナトリウムを測定するために設計されたナノセンサーの応答を決定するために使用されます。異なる濃度は、細胞外ナトリウム濃度のナノセンサーに使用することをお勧めします。 <ol><li> 10 mMのHEPES（0 NA）と10mMのHEPES（1 M Na）をし、pH、これらのソリューションの各7.2〜trizmaベースを使用して1Mの塩化ナトリウム（NaCl）のストック溶液を作る。 0、1、5、10、20、50、100、200、500、1000 mMのNaCl濃度：でソリューションを作成するために50 mlコニカル遠心チューブに0のNaと1 M Naのストック溶液を混ぜる。 </li><li>応答を決定するために光学底96ウェルプレートを使用してください。列の3ウェルにナトリウムのそれぞれの濃度の100μlを追加。これは3 × 10ウェルの配列を生成します。 </li><li>各ウェルマイクロプレート蛍光光度計に作りたてのナノセンサーと、負荷の100μlを加える。我々は、分子デバイスSpectramax M3を使用してください。 </li><li>以下の波長で各ウェルを読む： </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 励起（nm）の </td><td> 放射（波長） </td><td> カットオフ（NM） </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 570 </td><td> 530 </td></tr><tr><td> 488 </td><td> 670 </td><td> 610 </td></tr><tr><td> 639 </td><td> 680 </td><td> 665 </td></tr></tbody></table>各波長におけるナノセンサーの強度は、ナトリウム濃度に依存しています。波長の使用は、アプリケーションに依存します。細胞内のスローダイナミクスの測定では、我々は488 nm/570 nmの（励起/発光）と比率2つの波長をするために私達を許可し、ノイズを低減488 nm/670 nmを使用して。 <ol start="5"><li>伝統的に、optodeデータがある値に変換されます：α=（I - I 分）/（I maxと-私分 ）、私は与えられたナトリウム濃度で強度です、私は分が応答測定における最も低い強度である、そして私の最大の応答測定における最高の強度です。強度の比は、670 nmの強度やαから680 nmの強度で割った値570nmでのどちらかに変換します。 </li><li>作図用ソフトウェアを使用して、Excelや起源のどちらかが一般的に-1にゼロナトリウム濃度のログを設定し、ナトリウム濃度の対数対αをプロットするために、私たちのラボで使用されています。応答にS字状曲線をフィット。曲線から、センサーが最適に応答する濃度を表すα= 0.5でのナトリウム濃度を計算する。 </li><li>興味のナトリウム濃度の周りに最適な応答とナノセンサーを作成するoptodeでCHIII、NaIX、およびNaTFPBの比率を調整します。 </li></ol> 4。細胞内イメージング<ol><li>細胞内の測定では、ナノセンサーは、水中に5 mg / mlのグルコースで行われ、細胞にマイクロインジェクション。 </li><li>成長やガラス底皿やガラスのカバーの底部と画像処理チャンバーに細胞を移す。 </li><li>明確なメディアやタイロード液で細胞をインキュベートする。落射蛍光顕微鏡に画像処理室や料理をマウントします。我々はツァイスLSM 7共焦点顕微鏡を使用してください。 </li><li>ピペットプラーとガラスキャピラリーを引き出します。我々は300から500 nmの最終的な先端径には、1mm径、0.78 mm内径のガラスと茶色のp - 97燃えるサターを使用してください。 </li><li>埋め戻しナノセンサーシリンジとハミルトンの針を使用してソリューション、またはマイクロチップローダーとピペットとピペット。 </li><li>マイクロマニピュレータに取り付けられ、圧力制御噴射システムに接続されているホルダーにピペットをマウントします。ここでは、バーレイEXFOのPCS 6000マイクロマニピュレータとメディカルシステムズ株式会社インジェクタを使用してください。 </li><li>セルの上にピペットを下げ、細胞質中に、時にはそれがピアスに膜をマニピュレータのホルダーを"タップ"する必要があります。ナノセンサーソリューションを注入し、迅速にピペットを撤回。 </li></ol> （5）in vivoイメージング すべての手順は、ノースイースタン大学の動物実験委員会によって審査され承認されている。 <ol><li>ナノセンサーin vivoでのために、細胞外イメージングは、リン酸塩で作られている緩衝生理食塩水および135 mMのナトリウム濃度のナトリウムに対する最適な応答を持つように調整。 </li><li>インジェクションのセットアップとマウスの蛍光ナノセンサーのイメージングのため、我々は、IVISルミナIIおよびそれに関連する麻酔のユニットを使用してください。誘導とイメージング室を消毒する。誘導チャンバ内の場所CD1ヌードマウス（約20グラム）とイソフルランにそれらを公開する。 投与イソフルランと酸素流量の割合は、マウスの種と重量によって異なりますが。完全に麻酔になるためにマウスのを待ちます。 </li><li>マウスに麻酔をしたら、画像処理チャンバー内に誘導室と場所からマウスを取り外します。麻酔下でマウスを保持します。それぞれのマウスの場合は、希望する注入領域を消毒する。 </li><li>すべての気泡を除去することを確認してナノセンサーの10μLを滅菌した31Gインスリン注射器を埋める。 </li><li>鉗子を使用して、目的の注射部位でのマウスの背面に沿って皮膚の小さな倍を把握する。皮膚をつかんで、上向きにベベルと皮膚と皮膚に針を平行に注射器を挿入する。 </li><li>センサーを注入する前に、針が血管内に挿入されないようにシリンジのプランジャーを後方に引いて。その後、そっと針を右に移動し、皮膚内ポケットを作成するために残しました。これは、センサーが注射部位から漏れする原因となる背圧を最小限に抑えることができます。センサーを注入し、静かに注射器を取り外します。 </li><li>ゆっくりと注射部位に圧力を適用し、注射部位から漏出した可能性のあるソリューションを拭き取ってください。これは皮膚に注入されていないセンサーからの蛍光が最小限に抑えられます。 </li><li>希望の注入領域の数に達するまで繰り返されますから5.7 5.4繰り返します。均等にバックの左側と右側に間隔をあけ六注射部位が推奨されています。針が皮膚に挿入することが困難になった場合、個々のマウスの場合は、針を変更してください。 針はマウス間で共有すべきではない。これは、マウスの間で病気の伝送やクロスコンタミネーションを最小限に抑えられます。 </li><li>イメージングナトリウム蛍光センサについては、我々は、最も近い640 nm/680 nmの（励起/発光）ナノセンサーのスペクトルに一致し、それはまた、皮膚の自家蛍光を最小限に抑えるフィルターセットを使用してマウスの明視野および蛍光イメージの両方を取得する。 </li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。ナトリウムの5種類のナノセンサーセットの応答曲線。各セットはCHIII、NaTFPB、PVCとDOSの同じ量だけNaIXの様々な量を持っていた別のoptode製剤からナノセンサーを表します。データは、680分の639 nmの強度を用いてα値に変換されていました。データは、Originを使って近似S字カーブで、明確に省略さ3、エラーバーの平均です。この応答曲線では、使用されるナトリウムの最大濃度は500 mmであった。ナトリウム、ナトリウムのナノセンサーのKdは、10mM（オレンジ色のダイヤモンド）から約150mm（黒い正方形）の範囲であった。 <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2新生児心筋細胞を注入した。細胞は、顕微鏡に装着され、ナトリウムのナノセンサーを注入、カバーガラス上で培養した。蛍光（639 nm励起）、明視野、およびオーバーレイも表示されます。いくつかのセンサーのクラスタリングが発生するが、細胞が正常な形態を持って、センサーは細胞質全体に拡散しているとは核の負荷がないことに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2896/2896fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> ナトリウムのナノセンサーを持つマウスの図3。皮下注射。ナトリウムのナノセンサーの9種類の注射は、ヌードマウスの皮下空間に作られた。明視野と蛍光像（680分の640）の両方が重ね合わされる。

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利害の衝突は宣言されません。

optodeソリューションが行われ、PEG脂質は乾燥された後、ナノセンサーの形成は、10分以上も時間がかかるはずです。必要なときOptodeだけ迅速に行うことはできませんが、摂氏4度で保存した場合、彼らは数ヶ月のために安定させることができる。しかし、ケアは光からナノセンサーをブロックすることにより、この時間の経過とともに退色を防止するためにとるべき6ナトリウムのナノセンサーは、ここに示されたが、optodesがされている;。私たちは、一度形成nansensorsが、、少なくとも1週間溶液中で安定であることが示されているこのようなカリウムと塩化物のようなほとんどの生物学的に関連するイオンのために作成。10,12また、グルコースなどの小分子には、この技術を拡張しました。13 別の検体を監視するためのナノセンサーを生成するだけでなく、これらのナノセンサーは、ほとんどの生物学的実験において、それらを有用になるその他の変更に適している。例えば、表面コーティングが、この場合、ポリ（エチレングリコール）は、容易に水溶性である任意の両親媒性分子を使用して変更することができます。これにより、異なるアプリケーションまたはターゲットのためにこれらのナノ粒子を官能の可能性を可能にします。ナノ粒子のサイズは、表面コーティング、超音波処理の強度や溶剤を変えることによって調整することができます。 カルシウム蛍光指示薬は、細胞内カルシウムシグナル伝達を決定する上で非常に貴重されているが、使用可能なナトリウム感受性色素は同じ理想的な特性を持っていません。 Optodeは、我々は、うまくいけばナトリウムのシグナル伝達が細胞機能に影響を与えるかを理解するための手段を提供する細胞内のナトリウムのイメージングのための特定のナノセンサーを作成するには、この以前の研究で構築されている14。細胞内に年間の開発にされているイメージングイオンのための代替方法を提供することを目的とナノ粒子特定の疾患につながるシグナル伝達の変化。 in vivoでの蛍光ナノセンサーの使用は、血液が描くような他の方法より分析物を監視するためのリアルタイムの低侵襲代替手段を提供しています。上記の技術に基づいて3ナトリウムとブドウ糖ナノセンサーは、ナトリウムとブドウ糖の変化を追跡することが示されている、それぞれの生体 。3,13はしかし、現在、監視ツールとしてこの方法に制限が存在する。例えば、センサーは十分に皮膚からのバックグラウンド蛍光を最小限に抑えるために、赤近赤外にシフトスペクトルを持つ蛍光体が含まれている必要があります。15秒、電流注入法などによって発生する可能性があるナノセンサーの均一な注入を生成しない注入の深さのばらつきなどのエラー。これらの制限があるにもかかわらず、これらの蛍光ナノセンサーとその成功デモの開発は、患者の健康状態を監視するため、これらのセンサーは非常に貴重な研究ツールと方法することができます。

<table border="1"><tbody><tr><th>製品名</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> IVISルミナIIのインストゥルメントのパッケージ</td><td>キャリパーライフサイエンス</td><td> 126273 </td><td></td></tr><tr><td> CD - 1ヌードマウス</td><td>チャールズリバー</td><td>ひずみコード：086 </td><td>免疫不全</td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td> BD </td><td> 328438 </td><td> 3月10日CC mLを 、8mmの31G </td></tr><tr><td>高分子量ポリ塩化ビニール</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> DOS </td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> CHIII </td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaTFPB </td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaIX </td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>薄壁ガラスキャピラリー</td><td>サター</td><td></td><td></td></tr><tr><td> PEG脂質</td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1は、この手順で使用する化学物質や機器のリストを提供します。記載されていないすべての一般的な化学物質はSigmaから購入した。

生体内イオン濃度の測定のための蛍光ナノ粒子

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

体全体に厳密に制御イオンの恒常性は、脱水などのような衰弱状態の予防に必要です。対照的に1が 、細胞レベルでの迅速なイオンフラックスが興奮性細胞の活動電位を開始するために必要な2ナトリウムの規制は、の両方で重要な役割を果たしているこれらのケースは、しかし、方法は現在、継続的に生体 3と4は、カルシウムプローブと同様の詳細な結果を提供していない細胞内のナトリウムのプローブでナトリウム濃度を監視するために存在しません。これらのボイドの両方を埋めるための努力では、蛍光ナノセンサーは、in vitroおよび in vivo でのナトリウムの濃度を監視できるよう開発されている。5,6これらのセンサは、イオン選択optode技術に基づくとのナトリウム特異的認識可塑化ポリマー粒子で構成されています要素、pH感受性蛍光色素、および添加物が埋め込 ​​まれている。7-9機構的に、ナトリウムの認識要素は、センサーにナトリウムを抽出します。10この抽出が引き起こすセンサ内の電荷の中立性を維持するために水素イオンを放出するpH感受性蛍光体を起こす蛍光の変化。ナトリウムセンサーは、彼らの直径は約120nmである6。高い細胞内濃度でもカリウムを介してナトリウムを元に戻せると選択的であると生体適合性を付与するためにポリエチレングリコールでコーティングされています。マイクロインジェクションの技術を使用して、センサーは、それらが心筋細胞の拍動の時間的および空間的なナトリウムの動態を監視することが示されている細胞の細胞質内に送達することができます。注入した場合、さらに11彼らはまた、in vivoでのナトリウム濃度のリアルタイムの変更を追跡している皮下マウスへの3ここでは、我々は詳細に説明すると蛍光灯、ナトリウムのナノセンサーを製造するための方法論を示し、簡単に私たちの研究室がためにナノセンサーを使用する生物学的用途を示しています：。細胞内へのセンサーのマイクロインジェクションを、そしてマウスへのセンサーの皮下注射。

私たちの研究室で生産された蛍光ナノ粒子は、そのような生理的恒常性の間のシグナリングおよび間質液中の細胞のような生物学的システムにおけるイメージングイオン濃度とイオンのフラックスに使用されます。

脱水症のような衰弱状態を防ぐには、全身においてイオン恒常性が厳密に制御されていることが不可欠である。1 対照的に、急速なイオン...

本実験の全体的な目的は、in vitroおよびin vivoアプリケーション向けのナトリウムナノセンサーを作製することです。これは、ナノセンサーの構成成分を含むオプト混合物を調製することによって達成されます。第2ステップとして、水溶液中で界面活性剤を超音波処理して均一に分散させ、そこにオプトを添加することでナノセンサーを形成させます。次に、超音波処理を行いながら、オプト混合物を水溶性界面活性剤混合物に添加し、溶液中でナノセンサーを形成させます。このビデオでは、センサーの応答が調整可能であることを示しています。これらのセンサーは心筋細胞に微量注入できるほか、マウスへの皮下注射も可能です。蛍光指示薬などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、センサーを生理学的環境に適合するダイナミックレンジに調整でき、より広範な分析物を測定できるほか、定量分析のためにレシオメトリック測定が行える点にあります。一般的に、この方法に不慣れな方は、センサー作製後にそれを生物学的環境に導入することに困難を感じる場合があります。オプトセンサーを作製する前に、記載のプロトコルに従って、dry sodium ion four x dry sodium TFPBおよびchromo four threeのストック溶液を準備しておく必要があります。ドラフトチャンバー内で、すべての材料を1.5 milliliterのガラスバイアルに合わせます。テフロンコーティングのスクリューキャップを閉め、すべてのPVCが溶解するまでバイアルを緩やかにボルテックスします。溶液は赤色になります。4 gのガラスバイアルに、10 mg/mLのPeg lipidを100 µL加えてナノセンサーの作製を開始します。次に、10 mMのhippiesなどの目的の水溶液を4 mL加えます。ラボジャッキを使用して、超音波ホーンの先端をバイアル内に7 mmまで浸し、低出力で30秒間ソニケーションを行います。0.6 mLチューブに、ピペットを用いてオプト材料50 µLとジクロロメタン50 µLを加え、均一に混合させます。次に、3分間のソニケーションを開始します。ソニケーションを開始すると同時に、ピペットチップを浸し、オプト混合液 100 µL を一度に素早く均一に注入して加えます。pH が 7 を超えた場合、および溶液から残留 THF およびジクロロメタンを除去するためのナトリウムがない場合は、溶液が青色に変化します。ソニケーションチップの深さを 2 mm に移動させます。残り3分が経過すると、溶液は不透明になります。ソニケーションが完了したら、ナノセンサー溶液を5 mLシリンジで吸い上げます。フィルターを取り付け、ナノセンサー溶液をスクリューキャップ付きのガラスバイアルに分注します。まず、ナノセンサーの感度を測定するために、ナトリウム濃度を段階的に上昇させた10種類の溶液を調製します。0 Mおよび1 Mのナトリウムストック溶液を50 mLコニカルチューブ内で混合します。次に、光学底96ウェルプレートの1列につき3つのウェルに、各濃度のナトリウム溶液を100 µLずつ加えます。次に、調製したばかりのナノセンサーを各ウェルに100 µLずつ加え、プレートをマイクロプレート蛍光光度計にセットし、使用する発色団に最適な励起・蛍光・カットオフ波長を入力します。測定波長の選択はアプリケーションによって異なります。これらの波長を設定することで、細胞内の高速ダイナミクスの測定やノイズの低減が可能になります。α値を求めるには、570 nmにおける強度の比を、670 nmまたは680 nmにおける強度で除します。α値をナトリウム濃度の対数に対してプロットします。なお、ナトリウム濃度0の対数は-1として設定します。次に、応答にシグモイド曲線を当てはめ、その曲線からα値が0.5となるナトリウム濃度を算出します。これは、センサーが最適に応答するナトリウム濃度を表しています。この情報を基に、optoにおけるsodium iono four x sodium TFPBとchromo iono four threeの比率を調整し、最適なナトリウム濃度を持つナノセンサーを作製します。例えば、4つの10のナトリウム量のみが異なる、異なる光学的処方を表す5種類のナノセンサーセットのヒューロー応答曲線を示します。細胞内イメージングを行う場合は、細胞培地をTyro溶液のような透明な培地に置き換え、細胞をイメージングチャンバーに移動させます。次に、水に5 mg/mLのグルコースを溶解して調製したナノセンサー溶液を、引き伸ばしたガラスピペットに充填します。次に、ピペットをマイクロマニピュレーターに取り付け、圧力制御注入システムに接続します。ピペットを細胞の上にまで下げ、細胞質内に挿入します。膜を貫通させるために、マニピュレーターホルダーを軽く叩く必要がある場合があります。数百ピコリットルのナノセンサー溶液を注入し、速やかにピペットを抜きます。麻酔チャンバーを用いて、イソフルランでCD-1ヌードマウスを麻酔させます。麻酔が完了したら、マウスを消毒済みのイメージングチャンバーに入れます。次に、滅菌済みの31ゲージインスリン用注射器に、10 millimolar PBSで調製した適切なKD値を持つナノセンサーを10 µL充填します。ピンセットを使用して、すべての気泡を取り除いてください。注射部位となるマウスの背中の皮膚を、皮膚を掴みながら小さくつまみ上げます。針の斜面を上に向け、皮膚と平行になるようにシリンジを刺入します。次に、シリンジのプランジャーを後方に引き、針が血管に入っていないことを確認します。背圧を最小限に抑えるため、針を左右にゆっくりと動かし、皮膚内にポケットを作ります。次にセンサーを注入し、ゆっくりとシリンジを抜きます。注入部位を軽く圧迫し、注入部位から漏れ出した溶液を拭き取ってください。通常、背中に沿って等間隔に6か所注入します。異なるマウスで実施する場合は、疾患の伝播および交叉汚染を最小限に抑えるため、針を交換してください。注射後、ナノセンサーの励起・蛍光スペクトルに密接に一致するフィルターセットを使用して、明視野像および蛍光像を取得します。これにより、皮膚の自家蛍光も最小限に抑えられます。これらの新生児心筋細胞をカバーガラス上で培養し、ナトリウムナノセンサーを注入しました。この蛍光画像は639 nanometerの励起波長で撮影したものです。こちらは同じ細胞の明視野画像であり、最後はこれら2つの画像の重ね合わせです。センサーの凝集が一部で見られますが、細胞の形態は正常です。センサーは細胞質全体に拡散しており、核への蓄積は見られません。この明視野像と蛍光像のオーバーレイ画像は、ヌードマウスの皮下組織にナトリウムナノセンサーを9箇所に皮下投与した様子を示しています。適切に行えば、ナノセンサーの作製は数分で完了し、可逆的なリアルタイムの分析物変動を測定するあらゆる研究に応用できます。このビデオを視聴することで、生物学的環境における定量測定のために、ナノセンサーを細胞内または皮下空間に導入する方法について十分に理解できるはずです。

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生体内イオン濃度の測定のための蛍光ナノ粒子

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