Name: アクティブな細胞培養のための形状記憶ポリマー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学ぶ形状記憶ポリマーを用いた動的細胞培養基板の作製法。温度刺激により基板形状が変化し、蛍光顕微鏡で細胞挙動の変化を観察できる。組織工学への応用が期待される革新的な手法である。

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著者らは、ACC基板の準備と技術支援のためにケリーA.バークに感謝したいと思います。 。ら 、 バイオマテリアルに掲載された記事、デイビスKAに基づいて、動的な細胞の形状記憶ポリマー基板上への行動、 生体材料 、土井：10.1016/j.biomaterials.2010.12.006、著作権エルゼビア（2011）。この材料は、グラント番号DMR - 0907578の下NSFによってサポートされている作業に基づいています。

1。 NOA63の等温UV硬化<ol><li>カスタム硬化チャンバーは、 図1に示すようにガラスのスライド（75ミリメートル× 25ミリメートル× 1mm）を、厚さ1mmのテフロンスペーサー、及びアルミ板を（75ミリメートル× 25ミリメートル× 3mm）を使用して開発されました。チャンバーは、小さなバインダークリップを用いて一緒に開催されます。 </li><li> 18ゲージの針を使用してテフロンのスペーサーの穴を通ってチャンバ内にNOA63を注入する。 NOA63を穏やかに注入を容易にするために加熱することができます。 </li><li> ° C、5分間均一な温度に加熱することができるように125に設定したホットプレート上でチャンバーを配置。 </li><li>ガラスの表面からランプ6.5センチメートルて20分間、（表を参照してはλmax = 365nm）をUVランプ室内のNOA63を事前に治す。 </li><li>暖かいカミソリの刃を使用しながらチャンバーからNOA63を削除します。 </li><li> 125℃のホットプレート上で3時間40メートル℃でUV光下でNOA63をポストキュア</li><li> -20℃で乾燥NOA63を保存する</li></ol> 2。 NOA63の形状記憶特性<ol><li>その寸法を図2に示されているカスタマイズされたパンチと硬化NOA63フィルム（表を参照）、ホットキーを押すことでダンベル状試験片を準備します。 </li><li>引張治具と、動的機械分析装置（表を参照してDMA）に検体をロードします。次のようにプログラムして、テスト手順をモード"の制御を強制的に"するために楽器を設定します。 <ol><li> 95.00で平衡化° C </li><li> 10.00分間等温</li><li>ランプ力0.300 N / minまで2.500 N </li><li> 5.00分間等温</li><li>ランプ2.00 20.00 ° C /分° C </li><li> 10.00分間等温</li><li>ランプ力0.300 N /分0.015〜N </li><li> 5.00分間等温</li><li>ランプ2.00 95.00℃/分° C </li><li>手順の2から9までをさらに2回繰り返す</li></ol></li></ol> 3。アクティブな細胞培養基板の作製<ol><li>個々のサンプルは等温硬化SMPフィルムから調製することができる。必要なサンプルサイズにかみそりでSMPのフィルムを切り取ります。率を低下し、カットを容易にするためのT gより高い温度に設定したホットプレート上でSMPを置きます。 </li><li>一時的な形状は、さまざまな方法で修正することができます。ここでは、一時的な地形をエンボスする冷却/加熱プラテンとベンチトップ油圧プレスを使用してください。 Tgが上記の温度でプラテンの温度を設定します。 </li><li>点字は、ビニールレコードでエポキシを硬化させることにより行われた。これは、平行な溝の一時的な形状を生成します。ここで、点字が35〜40μmの高い三角形のピークがあったとは別に60μm幅、間隔80μmである。点字は、他の材料から、さまざまな地形で行うことができますが、エンボス加工温度でNOA63より硬めにする必要があります。 SMPのサンプルが点字に下向きに配置し、プレスでサンプルと点字を配置。 </li><li>加熱プラテンとサンプル間の接触を行い、試料が均一な温度に達するように〜5分間保持するために〜100 kPaのプリロードを適用します。 </li><li>サンプルに1から6メガパスカルを適用し、1分間保持する。 4.7メガパスカルの応力は、点字の地形の不完全な複製につながります。生成された一時的な地形は、25〜35μmの高さ150μmの広いピークを四捨五入しています。大きなストレスが印加されている場合、SMPが破損することになります。小さい振幅で地形を紹介する小さなストレスを適用します。 </li><li> T g未満の温度を減少させる。ここでは、プレスプラテンの水の冷却機能を使用してください。 </li><li>温度がT g未満の場合は、加えられる力を取り外します。 </li><li>サンプルは-20℃で乾燥保存することができます。これらの条件下で保存した場合、我々はビニールレコードの点字をエンボス加工サンプルの2ヶ月後に振幅の回復には1μmの減少よりも小さいを観察している。 </li></ol> 4。アクティブな細胞培養実験<ol><li>生物学的安全キャビネット（BSC）の紫外光は、試料を滅菌するために使用されます。サンプルはふたなしで滅菌皿に裏向きに配置し、6時間BSCのUVライトをオンにする</li><li>表向き新しい滅菌シャーレに試料を反転させる。 6時間BSCのUVランプをオンにする</li><li>サンプルは、細胞とメッキの前に比較的安定した状態に平衡化する必要があります。 96ウェルプレートに試料を置き、完全増殖培地150μlを加える。 </li><li>目的の部分的な回復に達するまで、5％CO 2で30℃インキュベーターでプレートを置く。ここでは、セルを整列するために十分な大きさの振幅で試料を作製するために30時間を使用してください。 </li><li>サンプルは、現在のセルでめっきすることができる。新しい96ウェルプレートにサンプルを置きます。 </li><li>サンプルに細胞溶液150μlを加え。ここでは、分離した細胞を（一般に他の細胞と接触して）達成するために20,000細胞/ mlでC3H/10T1/2マウス胚線維芽細胞を使用してください。 </li><li>細胞は9.5時間にわたって30℃インキュベーターで、場所を添付し、一時的な地形に広がるできるようにするには</li><li>アッセイ細胞morpholへ遷移前ogy、サンプルを削除し、染色し、試料の蛍光イメージングを行う。この材料は、紫外線と可視域の大部分を自己蛍光示す。などのAlexa Fluor 647のようなスペクトルの遠赤端に蛍光色素は、バックグラウンドを減らすことをお勧めします。 </li><li>回復するためにサンプルをトリガーするために、37℃のインキュベーターにプレートを移動させ、新たな地形にその形態を適応させるために細胞を回収し、許可するように材料を可能にするために19時間培養を続ける。 </li><li>サンプルを削除し、適切な染色（線維状アクチンイメージングファロイジン）と撮像法を適用する。 </li></ol> 5。代表的な結果： NOA63を硬化すると、 図3に示すように優れた形状記憶特性を持つ透明な、ガラス状の固体である。この場合、材料は上記のプロトコル1のように硬化および51.1の均一T gを示していた° C（E'ドロップダウンの開始から決定）。それは株の大部分が20℃アンロード後に固定された、という一方通行の形状記憶サイクル（加熱、回復、冷却、変形する、 図3）° C、89.3の固定比率15（R F）に相当するから観察され％（3サイクルにわたって平均を表し、R rの同じ下）。固定株は、加熱時の比較的小さな温度範囲で84.4パーセントの回収率（R R）で回収。全ての曲線が互いにほぼ正確に従うという点でさらに、形状記憶性能は、3つのサイクルにも劣化を示さなかった。 NOA63は、それが製造業者から容易に利用できるため、このプロトコルで使用され、光開始剤と容易に硬化無溶剤型プレポリマーとして供給されました。しかし、その組成は供給者によって開示されていない。それは、高い細胞接着と生存率を可能にすることがわかった。最後に、転移温度は、2つのセルの互換性のある温度の間に回復の意味の大きさを許可するように調整することができます。転移温度は、細胞培養と互換性があるかどうか、彼らは細胞接着と生存率を促進する場合、他のポリマー系の数も、このプロトコルで使用することができる。 一時的な地形の振幅（溝）が30で、時間の経過に従って短く℃の30 ° Cで30 hによって、振幅が約50％（ 図4、時間0）16分短縮されました。それは次の9.5時間かけて別の10％を削減回復は、温度を37増加させることによりトリガーされると° C、振幅は9.5時間以内に初期振幅の0.5％に削減使用される点字および4.9 MPaのエンボス加工ストレスの場合、これはほぼ平坦な表面から13μmの溝の機能的変化に対応しています。 アクティブな細胞培養基板を使用して制御セルの動作の例は、細胞骨格の組織の変化である。リカバリーが起動される前に一時的な溝基板上に、アクチンミクロフィラメントは、溝（ 図5a）16の方向に沿って整列します。温度上昇によって回復した後、マイクロフィラメントは、再編成し、ランダムに配向されている。静的溝または静的平らな面を持っているコントロールのサンプルは、温度の上昇（ 図5b、c）の後に再編成しないでください。 <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：NOA63硬化室の回路図。断面図（左）とガラスカバー（右）のないトップダウンビュー。 <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：バルク形状記憶の特性評価に使用するダンベル形状W：狭いセクションの幅、L：狭いセクションの長さ、G：ゲージ長、WO：幅全体の、LO：全長、D：グリップ、R間の距離：フィレットの半径、およびRO：外側の半径。 <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3：シングルNOA63治療法のバルク一方向の形状記憶は、3回（アスタリスクは、実験的な発症を示す）を繰り返す。アスタリスク（*）で示される時点では、ポリマーが加熱され、その一時的な形状を定義するためにストレスを印加することによって変形される。このひずみは一定に保たれ、温度は、ポリマーの Tg以下の一時的な形状を修正するために減少しています。次いで温度を上昇し、一時的な歪みが低減されるような材料は、恒久的な形状に回復している。 <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4：SMPの回復は、細胞培養と互換性のある温度の下で開始することができます。 25.6の振幅±0.8μmには、次のエンボスRECを提示± 1.5μmの30で30時間平衡化した後、12.6 overed ° C（時間0、黒丸）。サンプルは37℃インキュベーター（9.5時間）に移動した後に、振幅は3.5時間以内に1.1 ± 0.2ミクロンにまで回復振幅は（赤の三角形）が観察された〜0.3 ± 0.1 9.5時間以内程度と最後の9.5時間以上、検出可能な低下にまで回復。エラーバーは、一つの標準偏差（n = 4-6）を表す。トレースは、代表的なサンプルの接触形状測定のスキャンです。 <img src="/files/ftp_upload/2903/2903fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5：セルのアクチン細胞骨格は、地形の移行は、次の再配列、エンボス加工基板上ファロイジンで染色した細胞の共焦点画像は、転移と温度上昇の前に溝方向（白矢印）に合わせマイクロフィラメントを示す。移行後は、マイクロフィラメントが再配置されているランダムに配向している。bは、平坦な制御基板上に細胞が温度上昇する前と後にランダムに配向マイクロフィラメントを示す。C、溝制御基板上のセルには温度上昇の前と後の溝方向に沿ったマイクロフィラメントを示す。スケールバーは100μmである。トレースは、 図4のとおりです。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

NOA63のT gは簡単に硬化温度で制御することができます。我々は細胞互換性のある範囲内で誘発されることSMP基板を生成するために、これを使用する。 NOA63が乾燥したT gを下げる水により可塑化されるので、° Cが30及び37℃の間にぬれたTgの範囲を移動する125℃硬化させることにより乾燥したT gを増加実証アクティブな細胞培養の基質は、細胞挙動を制御することができます。マイクロフィラメントの再編成の結果は、動的な基板上の制御およびアッセイ細胞の振る舞い​​の両方の可能性を強調する。 ACC基板トポグラフィーの準備は、硬化型と点字の形状に基づいて、シンプルで拡張可能です。 、ナノスケール、マイクロ、およびメソスケールでの地形は、一時的な形状のための永久的な形状やエンボス加工のように硬化させることができます。さらに、細胞は高い生存性を維持し、付着してNOA63 16日に広がった。 SMPとしてNOA63の使用は、改善のためのいくつか...

<table border="1"><tbody><tr><td>試薬や器具の名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント（省略可能） </td></tr><tr><td> NOA63 </td><td>ノーランドプロダクツ株式会社</td><td> NOA63 </td><td>ロット番号111 </td></tr><tr><td>ドッグボーンパンチ</td><td> TestResource、株式会社シャコピー、ミネソタ州</td><td></td><td>スケールダウンされたIV型ドッグボーン（ASTM D638 - 03） </td></tr><tr><td>ベンチトップ型油圧プレス</td><td>カーバー</td><td> 3851 </td><td></td></tr><tr><td> C3H10T1 / 2マウス胚線維芽細胞</td><td> ATCC </td><td> CCL - 226 </td><td></td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット</td><td>サーモフィッシャー</td><td> 1357 </td><td></td></tr><tr><td> UVランプ</td><td> Spectroline </td><td> SB - 100PC </td><td></td></tr><tr><td>動的粘弾性装置（DMA） </td><td> TAインスツル株式会社</td><td> Q800 </td><td></td></tr><tr><td>倒立型蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>ライカDMI 4000B </td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> LSM 710 </td><td> 20x/0.8 NA空気または40x/1.30 NAの油浸対物</td></tr></tbody></table>

アクティブな細胞培養のための形状記憶ポリマー

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

形状記憶ポリマーは、（SMPS）の固定、一時的な形状からそのような熱〜5程度の刺激の印加時にあらかじめ決められた永久的な形状に変更する能力を持っている&quot;スマート&quot;の材料のクラスです。典型的な形状記憶サイクルでは、SMPは、まず、その転移温度、T トランス [いずれかの融解温度（T m）またはガラス転移温度（T g）]よりも高い高温で変形される。変形は本質的に弾性であり、主に構成するネットワークのチェーン（ゴム弾性の理論に続く）のコンフォメーションエントロピーの減少につながります。外部の歪みや応力を一定に保ちながら変形SMPは、そのT トランス以下の温度に冷却される。冷却時、より硬質状態（半結晶性またはガラス）、速度論的にトラップまたは&quot;フリーズ&quot;巨視的な形状の固定につながるこの低エントロピー状態の物質の材料に移行。形状回復は継続的にストレスのない（制約されていない）状態でT トランスを介して材料を加熱することによってトリガされます。一時的な形状から永久的な形状への重大な変更、それらの熱力学的に有利、最大エントロピー状態にリラックスしてネットワークのチェーンを（取り戻した移動度を持つ）ことを可能にしています。 細胞は、その周囲の環境6の機械的性質を調査することが可能です。メカニズムは、経由する細胞とそれらの物理的な環境制御セルの動作との間の力学的相互作用が活発な研究の領域です。定義されている地形の基質は、これらのメカニズムの研究における強力なツールとして浮上している。メソスケール、マイクロスケール、および基板の地形のナノスケールのパターンは、セルの配置、細胞接着、および細胞の牽引力7-14を導くことが示されている。これらの知見は、細胞培養中に細胞とその物理的環境との間の力学的相互作用を制御し、分析するために基板の地形の可能性を強調しているが、これまでに用いられる基板は、一般的に消極的だったと文化の間に大幅に変更するようにプログラムすることができませんでした。この物理的な停滞は、培養中の細胞を制御するための地形基板の可能性を制限している。 ここでは、アクティブな細胞培養（ACC）SMPの基板は、基板の地形や変形のプログラム制御を提供するために、表面の形状記憶を採用することを紹介しています。これらの基板は、一時的な溝地形から二番目、ほぼ平坦な記憶地形に移行する能力を実証。地形の変化は、標準細胞培養条件下での細胞挙動を制御するために使用することができます。

培養中に地形を変更する機能を細胞培養基板を開発するための方法が説明されています。このメソッドは永続的な形状を記憶する能力を持つ形状記憶ポリマーとして知られているスマート材料を利用しています。この概念は、材料と幅広い用途に適応可能です。

形状記憶ポリマー（SMP）は、固定された一時的な形状から、あらかじめ設定された永久的な形状へと変化する能力を持つ「スマート」材料の一種です。

この手順の全体的な目的は、経時的にトポグラフィーが変化する基質中で細胞を培養することです。これは、まず形状記憶ポリマーを記憶可能な永久形状にプログラムすることで達成されます。その後、形状記憶ポリマーを一時的な形状にプログラムし、そこに細胞を播種します。手順の最終ステップは、温度を上げて形状記憶ポリマーを永久形状に復帰させることであり、最終的に蛍光顕微鏡を通じて細胞の挙動の変化を示す結果を得ることができます。こんにちは、パット・マザーです。私はシラキュース大学で生体医工学および化学工学の教授を務め、シラキュース生体材料研究所の所長をしています。細胞を伸展させるための市販装置やカスタム装置と比較して、本手法の主な利点は、単一のポリマー系において、細胞に多種多様で複雑な歪みを負荷できることです。私はジェイ・ヘンダーソンです。生物医学・化学工学の助教であり、シラキュース生物材料研究所のメンバーです。この手法は、細胞が物理的環境の動的な変化にどのように反応するかといった、メカノバイオロジー分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。私はケビン・デイビスです。シラキュース大学の生物医学工学および化学工学部の博士課程学生です。この手法は2Dのメカニカルバイオロジーに関する知見を提供しますが、組織工学用の3D形状変化スキャフォールドなど、他のシステムにも応用可能です。本手順を開始する前に、ガラススライド、厚さ1 mmのテフロン製スペーサー、およびアルミニウムプレートを用いて、カスタムキュアリングチャンバーを準備します。小型バインダークリップでチャンバーを固定し、18ゲージの針を用いて、テフロン製スペーサーの穴からNOA 63をチャンバー内に注入します。その後、チャンバーを125 °Cに設定したホットプレート上に置きます。チャンバーの加熱後、温度が均一になるまで5分間待機します。ガラス表面から6.5 cmの距離にUVランプを配置し、NOA 63を20分間硬化させます。NOA 63がまだ温かいうちに、カミソリ刃を用いてチャンバーから取り出します。次に、形状記憶ポリマーを125 °Cのホットプレート上に直接置き、UVライト下で3時間40分間ポストキュアします。NOA 63の形状記憶特性を評価するため、カスタムパンチを用いてキュア後のフィルムを熱プレスし、ダンベル型試験片を作製します。最後に、引張治具を備えた動的機械分析装置に試験片をロードします。装置を荷重制御モードに設定し、本ビデオに付随する書面プロトコルに従って試験手順をプログラムします。この手順の結果、等温硬化させた形状記憶ポリマー（SMP）フィルムが得られます。モジュラスを低下させ、切断しやすくするために、等温硬化SMPをホットプレートに置き、温度をガラス転移点より高く設定します。等温硬化SMPフィルムから個々のサンプ

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Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このプロトコルでは、我々は技術がベースとなっている垂直方向に変位の記事のマイクロアクチュエータアレイの製作、そしてどのようにこの基盤技術は2次元と3次元の両方の文化の中でハイスループット機械的にダイナミックな細胞培養を実施するように変更することができますを示していますパラダイム。...

機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

簡単なテクニックは、通常の細胞培養基板上への動的なマスク投影リソグラフィ用デジタルマイクロミラーデバイスを用いた微細加工神経培養システムの急速な生産のために説明されています。これらの培養系は、天然の生物学的なアーキテクチャのより代表的かもしれない、と説明された技法は数多くのアプリケーションに適応することができます。...

動的なマスク投影リソグラフィーを用いたニューラル培養システムのためのマイクロパターンハイドロゲルの作製

このビデオでは、グリア細胞の三次元培養を確立する技術を示しています。ラット脳由来のグリア細胞は、細胞外マトリックス成分を含む光架橋性ポリマーマトリックス内にカプセル化されています。増殖培地でインキュベートすると、グリア細胞は支持マトリックス内で増殖し、三次元培養を作製します。...

ラット脳由来グリア細胞の三次元培養法の確立

骨伝導性と生物活性を示しながら、頭蓋顎顔面(CMF)の骨欠損に適合できるスキャフォールドは興味深いものです。このプロトコルは、溶融塩テンプレートを使用する溶媒鋳造微粒子浸出(SCPL)法および生物活性ポリドーパミンコーティングの適用を使用して、ポリカプロラクトンジアクリレート(PCL-DA)に基づく形状記憶足場の調製について説明します。...

生理活性、PCLベースの「セルフフィット」形状記憶ポリマー足場の作製

スキャフォールドは、細胞ニッチの複雑な生化学的および生物物理学的な微小環境を再現する必要があります。ここでは、界面高分子電解質錯体化繊維をプラットフォームとして使用して、持続的な生化学的放出を伴う複合多成分高分子足場を作成する方法を示します。...

生体分子の時間的に制御された放出のための界面高分子電解質繊維の複合足場

シロキサンベースおよびエポキシベースの液晶エラストマー(LCE)およびLCEナノコンポジットの調製を実演します。LCEは、可逆ひずみ、液晶秩序、および剛性に関して特徴付けられます。潜在的なアプリケーションとして、活性細胞培養用のカスタムデバイスでの形状応答性基質としての使用を実証します。...

モノドメイン液晶エラストマーおよび液晶エラストマーナノコンポジットの調製

私たちは、三次元細胞培養アプリケーションのための合成ハイドロゲルマトリックスの光媒介形成とその後の生化学的パターニングの連続的なプロセスについて説明します。細胞適合性フォトクリックケミストリーによるハイドロゲルの構築と修飾が実証されています。さらに、これらのハイドロゲル内のパターンを定量化および観察し、細胞生存率を決定するための容易な技術が紹介されています。...

細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング

蛋白質ベースのヒドロゲルの三次元のアーキテクチャを操作するさまざまな方法は、材料特性に関してここで評価されます。マクロポーラス ネットワーク修飾が細胞接着ペプチドと細胞培養での実現性は、2...

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

ここハイドロゲルを用いた複雑な形状設計組織を生成するために使用できるカスタム...

カスタム設計されたレーザー エッチングのマスターから培養金型

粒状足場内の粒子画分のばらつきを最小限に抑えることで、再現性のある実験が容易になります。この研究では、 in vitro...

3D細胞培養のための微多孔性アニール粒子足場における粒子分率の制御(英語)

マイクロメートルスケールの3Dプリンティングにより、神経細胞培養用のポリマーデバイスのラピッドプロトタイピングが可能になります。原理証明として、ニューロン間の構造的結合は、神経突起伸長に影響を与える障壁とチャネルを作成することによって制約され、そのような操作の機能的結果は細胞外電気生理学によって観察されました。...

2光子重合によるマイクロスケール神経細胞培養装置の3Dプリンティング

学ぶ形状記憶ポリマーを用いた動的細胞培養基板の作製法。温度刺激により基板形状が変化し、蛍光顕微鏡で細胞挙動の変化を観察できる。組織工学への応用が期待される革新的な手法である。

アクティブな細胞培養のための形状記憶ポリマー

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