アクティブな細胞培養のための形状記憶ポリマー

この手順の全体的な目標は、時間の経過とともに変化するトポグラフィーを持つ基質で細胞を培養することです。これは、まず形状記憶ポリマーを記憶可能な永久的な形状にプログラミングすることによって達成されます。次に、形状記憶ポリマーを一時的な形状にプログラムし、後で細胞をプレーティングします。

手順の最終ステップは、温度を上昇させることによって形状記憶ポリマーをその恒久的な形状に戻すように引き起こすことであり、最終的には蛍光顕微鏡を通じて細胞挙動の変化を示す結果を得ることができます。こんにちは、パット・マザーと申します。私は、ここシラキュース大学の生物医学および化学工学の教授であり、シラキュース生体材料研究所の所長です。

この技術の主な利点は、細胞を伸ばすための市販の装置やカスタムの装置と比較して、単一の高分子系で、細胞に多種多様な複雑なひずみを適用できることです。私の名前はジェイ・ヘンダーソンです。私は生物医学および化学工学の助教授であり、シラキュースバイオマテリアル研究所のメンバーです。

この手法は、細胞が物理的環境の動的な変化にどのように応答するかなど、メカノバイオロジーの分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。私の名前はケビン・デイビスで、シラキュース大学の生物医学工学・化学工学科の博士課程の学生です。この手法は、2D機械生物学に関する洞察を提供しますが、組織工学のための3D形状変更足場などの他のシステムにも使用できます。

この手順を開始する前に、スライドガラス、厚さ1mmのテフロンスペーサー、およびアルミニウムプレートを使用してカスタム硬化チャンバーを準備します。小さなバインダークリップを使用してチャンバーを固定し、まず、18ゲージの針を使用してテフロンスペーサーの穴からNOA63をチャンバーに注入します。次に、チャンバーを摂氏125度に設定されたホットプレートに入れます。

チャンバーの加熱後、チャンバーを均一な温度に5分間加熱します。NOA 63を20分間調達するには、ガラスの表面から6.5センチメートルのところにUVランプを配置します。かみそりの刃を使用して、まだ温かいうちにNOA63をチャンバーから取り外します。

その後、形状記憶ポリマーをUV光の下で3時間40分、摂氏125度のホットプレート上で直接後硬化させます。NOA 63の形状記憶を特徴付けるには、硬化したフィルムをカスタマイズされたパンチでホットプレスしてダンベル試料を準備します。最後に、試験片を引張固定具付きの動的機械分析装置に入れます。

装置を強制制御モードに設定し、このビデオに付属するプロトコルに記載されているようにテスト手順をプログラムします。この手順の結果、等温硬化型形状のメモリーポリマーまたはSMPフィルムをホットプレートにCSMPを配置し、ガラス転移温度よりも高い温度を設定して、弾性率を下げ、切断を容易にします。等温硬化型sおよびpフィルムから個々のサンプルを調製します。

sフィルムとpフィルムをカミソリで目的のサンプルサイズにカットします。一時的な形状は、さまざまな方法で固定できます。ここは。加熱および冷却可能なプラットを備えたベンチトップ油圧プレスは、一時的なトポグラフィーをエンボス加工するために使用されます。

まず、PLAの温度をtg以上の温度に設定します。今回のデモでは、ビニールレコードにエポキシ樹脂を硬化させて、平行な溝を仮形状にしたエンボス加工機を製作しました。エンボス加工機は、他の材料や異なる地形で作ることができますが、NOA 63よりも剛性が高くなければなりません。

エンボス加工温度で、sとpのサンプルを下向きにしてエンボス加工器に置きます。次に、サンプルとエンボス加工機をプレス機に入れます。約100キロパスカルの予圧を加えて、加熱PLAとサンプルを約5分間接触させ、サンプルが均一な温度に達するようにします。

均一な温度に達したら、サンプルに1〜6メガパスカルを塗布し、1分間保持します。SMPが破損する。より大きな応力がかかる場合。

より小さな応力を適用して、より小さな振幅のトポグラフィーを導入します。加圧後、プレスプラーツの水冷機能を利用してTG以下に温度を下げてください。温度がtgを下回った場合は、活性細胞培養実験を開始する前に、加えた力を取り除

生物学的安全キャビネットのUVライトは、サンプルの滅菌に使用されます。サンプルを下向きにして蓋のない滅菌皿に並べ、UVライトを6時間オンにします。次に、サンプルを表向きの位置で新しい滅菌皿に裏返します。

UVライトをさらに6時間オンにします。サンプルは、セルでプレーティングする前に、比較的安定した状態に平衡化する必要があります。サンプルを96ウェルプレートに入れ、150マイクロリットルの全成長液を加えます。

井戸あたりのミディアム。プレートを摂氏30度のインキュベーターに5%CO2で置き、目的の部分回復に達するまで置きます。このデモンストレーションでは、サンプルを30時間インキュベートして、細胞を整列させるのに十分な大きさの振幅を生成します。

部分的な回収が達成されたら、サンプルに細胞を播種することができます。サンプルを新しい96ウェルプレートに入れます。次に、ここの各サンプルに150マイクロリットルの細胞溶液、C3 H 10 t半を加えます。

ほとんどの胚性線維芽細胞は、ミリリットルあたり20, 000個の細胞で使用されます。単離された細胞を達成するには、摂氏30度で9.5時間インキュベートすることにより、細胞が一時的なトポグラフィー上に付着して広がるようにします。次に、サンプルを取り出し、サンプルの染色および蛍光イメージングを行うことにより、移行前の細胞形態をアッセイします。

この材料は、Alexa Fluor 6 47のようなスペクトルの遠赤色端にある紫外線および可視範囲のフルオロフォーのほとんどを通じて自家蛍光を示しますが、バックグラウンドを減らしてサンプルを回収し、プレートを摂氏37度のインキュベーターに移動し、19時間培養を続けることが推奨されます。これにより、材料が回復し、細胞はその形態を新しいトポグラフィーに適応させることができます。インキュベーション後、糸状アクチンイメージング用のファリンなどの適切な染色剤を塗布します。

最後のステップとして、細胞は、ここに示されている単一のNOA 63硬化のバルク一方向形状記憶である新しいトポグラフィー上で画像化することができます。アスタリスクが実験的開始が治癒したことを示す3回繰り返します。NOA 63は、優れた形状記憶特性を持つ透明なガラス状の固体です。

この場合、材料は硬化し、貯蔵弾性率の低下の開始から決定される摂氏51.1度の均一なTGを示しています。ここで見られるひずみの低下は、測定されたtgで発生します。4.7%の印加ひずみの大部分は、89.3%の固定率に対応する摂氏20度の除荷後に固定されましたその後、加熱中の比較的小さな温度範囲で84.4%の比率で固定ひずみが回復しました。

形状記憶性能は、ほぼ同じ経路をたどるすべての曲線から明らかなように、3サイクルまで低下しませんでした。一時的な地形の振幅は、摂氏30度で時間の経過とともに30時間減少します。摂氏30度で。

振幅は約 50% 減少しており、ここでは時間 0 で示されています。次の9.5時間でさらに10%減少します。温度を摂氏37度に上昇させることで回復が引き起こされると、エンボス加工を使用した場合、9.5時間以内に振幅が初期振幅の0.5%に減少し、エンボス応力は4.9メガパスカルになります。

これは、13マイクロメートルの溝がほぼ平らな表面に機能的に変化することに相当します。このポリマーは、細胞培養条件下で30〜37度の温度範囲で回復します。これは、培養液からの水分の取り込みによるもので、水プラスチックはポリマーをサイジングし、tgを低下させ、乾燥TGの51度未満の温度での回復を可能にします。

活性細胞培養基質の使用によって制御される細胞挙動の一例は、一時的な溝付き基質上の細胞骨格組織の変化です。回復が引き起こされる前に、アクチンマイクロフィラメントは溝の方向に沿って整列します。温度上昇による回復後、マイクロフィラメントは再編成され、ランダムに配向されます。

逆に、静的、平坦、または静的な溝を持つコントロールサンプルは、温度が上昇しても再編成されません。この手順を試行する際には、硬化チャンバーの形状、ポリマーの転移温度、ひずみ固定の方法、ポリマー自体の組成をすべて調整して、独自の実験で目的の遷移を達成できることを覚えておくことが重要です。リアルタイムPCRなどの他の方法は、その開発後に、基質からの機械的刺激に応答して遺伝子発現がどのように変化するかなどの追加の疑問に答えるために用いることができる。

この技術は、細胞メカノバイオロジーの分野の研究者が、細胞の細胞骨格、再配列、およびソフトマターの物理学を2次元で研究する道を開きました。私たちの仕事に興味を持っていただき、ご覧いただきありがとうございます。