アクティブな細胞培養のための形状記憶ポリマー

この手順の総合的な目的は、時間の経過とともにトポグラフィーが変化する基材上で細胞を培養することです。これは、まず形状記憶ポリマーを記憶可能な永久形状へとプログラミングすることで達成されます。次に、形状記憶ポリマーを一時的な形状にプログラミングし、その後、その上に細胞を播種します。

手順の最終ステップは、温度を上げて形状記憶ポリマーを永久形状に戻すことであり、最終的に、蛍光顕微鏡を通じて細胞の挙動の変化を示す結果を得ることができます。こんにちは、パット・マザーです。私はシラキュース大学で生物医学・化学工学の教授を務め、シラキュース・バイオマテリアル研究所の所長をしています。

細胞を伸展させるための市販の装置やカスタム装置と比較して、この手法の主な利点は、単一のポリマー系において細胞に多種多様で複雑なひずみを適用できる点にあります。私はジェイ・ヘンダーソンです。生物医学・化学工学の助教であり、シラキュース生物材料研究所のメンバーです。

この手法は、細胞が物理的環境の動的な変化にどのように反応するかなど、メカノバイオロジー分野における重要な疑問を解明するのに役立ちます。私はシラキュース大学の生物医学工学および化学工学科の博士課程学生、ケビン・デイビスです。この手法は2Dのメカニカルバイオロジーに関する洞察を提供できるだけでなく、組織工学用の3D形状変化スキャフォールドなどの他のシステムにも応用可能です。

この手順を開始する前に、ガラススライド、厚さ1 mmのテフロン製スペーサー、およびアルミニウムプレートを用いて、専用の硬化チャンバーを準備します。小型のバインダークリップでチャンバーを固定し、18ゲージの針を用いて、テフロン製スペーサーの穴からチャンバー内にNOA 63を注入します。その後、125 °Cに設定したホットプレートにチャンバーを置きます。

チャンバーを加熱した後、5分間待機して温度を均一にします。UVランプをガラス表面から6.5 centimeters離して配置し、NOA 63を20分間硬化させます。NOA 63が温かいうちに、カミソリブレードを用いてチャンバーから取り出します。

次に、ホットプレート上で125 °Cに加熱しながら、形状記憶ポリマーをUV光で3時間40分間ポストキュアします。NOA 63の形状記憶特性を評価するために、カスタムパンチを用いてキュア済みフィルムを熱プレスし、ダンベル型試験片を作製します。最後に、引張治具を備えた動的機械分析装置に試験片をロードします。

装置を荷重制御モードに設定し、本ビデオに付属する書面プロトコルに従って試験手順をプログラムします。この手順の結果として、等温硬化した形状記憶ポリマー（SMP）フィルムが得られます。弾性率を低下させて切断しやすくするため、CSMPをホットプレートに置き、温度をガラス転移温度より高く設定します。等温硬化したSMPフィルムから個別のサンプルを準備します。

カッターを使用して、s および p フィルムを希望のサンプルサイズに切り出します。一時的な形状は、いくつかの異なる方法で固定することが可能です。ここでは、加熱および冷却が可能なプレートを備えた卓上油圧プレス機を用いて、一時的なトポグラフィーをエンボス加工します。

まず、PLAの温度をガラス転移点（tg）以上の温度に設定します。今回のデモンストレーションでは、ビニールレコード上にエポキシ樹脂を硬化させ、平行溝の一時的な形状を持つエンボッサーを作成しました。エンボッサーは他の材料や異なるトポグラフィーで作成することも可能ですが、NOA 63よりも剛性が高いものである必要があります。

エンボス温度にて、sサンプルおよびpサンプルをエンボッサーの上に裏向きに配置します。次に、サンプルとエンボッサーをプレスに入れます。加熱PLAとサンプルの間に接触を持たせるため、約100 kilo pascalsのプリロードを加え、サンプルが均一な温度に達するまで約5分間保持します。

温度が均一になったら、サンプルに1から6 MPaの圧力を加え、1分間保持します。これによりSMPが破断します。より大きな応力が加えられた場合、

より小さな振幅のトポグラフィーを導入するために、より小さな応力を加えます。圧力を加えた後、プレスプレートの水冷機能を用いて、温度をTG以下に下げます。温度がtg以下になったら、活性細胞培養実験を開始する前に、印加した力を取り除きます。

生物安全キャビネットのUVライトを使用してサンプルを滅菌します。滅菌済みの蓋なしディッシュにサンプルを裏向きに並べ、UVライトを6時間点灯させます。その後、サンプルを新しい滅菌済みディッシュに移し、表面を上に向けて配置します。

UVライトをさらに6時間照射します。細胞を播種する前に、サンプルを比較的安定した状態で平衡化させる必要があります。サンプルを96ウェルプレートに移し、完全成長培地を150 µL加えます。

ウェルあたりの培地量。プレートを5%CO2濃度の30°Cインキュベーターに入れ、目的の部分的な回復が得られるまで培養します。本デモンストレーションでは、細胞を配列させるのに十分な振幅を得るため、サンプルを30時間培養しています。

部分的な回収が完了したら、サンプルに細胞を播種できます。サンプルを新しい96ウェルプレートに移します。次に、各サンプルに150 µLの細胞懸濁液を添加します。

ほとんどの胚線維芽細胞は、1 mLあたり20,000個の濃度で使用されます。細胞を単離させるために、30 °Cで9.5時間インキュベートし、一時的なトポグラフィー上に細胞を接着・伸展させます。次に、サンプルを取り出して染色および蛍光イメージングを行い、転移前の細胞形態をアッセイします。

この材料は、UVおよび可視光領域の大部分で自家蛍光を示します。背景ノイズを低減させるため、スペクトルの遠赤色端にあるAlexa Fluor 647などの蛍光色素が推奨されます。サンプルの回復を促すには、プレートを37 °Cのインキュベーターに移し、さらに19時間培養してください。これにより、材料が回復し、細胞が新しいトポグラフィーに合わせて形態を適応させることができます。インキュベーション後、フィラメント状アクチンをイメージングするためのphalloidinなどの適切な染色剤を適用してください。

最終ステップとして、細胞をイメージングします。ここに示しているのは、単一のNOA 63硬化によるバルクの一方向形状記憶です。これを3回繰り返し、アスタリスクは実験的な硬化開始点を示しています。NOA 63は、優れた形状記憶特性を持つ透明なガラス状固体です。

この事例では、材料は硬化しており、貯蔵弾性率の低下の開始点から決定された一様なTGは51.1 °Cであった。ここで見られるひずみの低下は、測定されたtgで発生している。20 °Cで除荷した後に、印加した4.7%のひずみの大部分が固定され、固定率は89.3%であった。その後、加熱中の比較的狭い温度範囲において、固定ひずみが84.4%の割合で回復した。

すべての曲線がほぼ同一の経路を辿っていることから、形状記憶性能は3サイクルまで劣化しなかった。一時的なトポグラフィーの振幅は、30 °Cで30時間かけて経時的に減少する。30 °Cにおいて。

振幅は、ここに示す時刻0において約50%減少しています。その後9.5時間でさらに10%減少します。温度を37 °Cに上げて回復を誘導すると、使用したエンボッサーおよび4.9 MPaのエンボスストレスにおいて、振幅は9.5時間以内に初期振幅の0.5%まで減少します。

これは、13 µmの溝を持つ構造からほぼ平坦な表面への機能的な変化に相当します。このポリマーは、細胞培養条件下で30から37 °Cの温度範囲で回復します。これは培養培地からの吸水によるものであり、吸水によってポリマーが可塑化され、tgが低下するため、乾燥時のTGである51 °Cより低い温度での回復が可能になります。

能動的な細胞培養基質を用いて制御される細胞挙動の一例として、一時的な溝付き基質上での細胞骨格組織の変化が挙げられます。回復が誘発される前は、アクチンマイクロフィラメントが溝の方向に沿って整列します。温度上昇によって回復した後、マイクロフィラメントは再編成され、ランダムな方向を向いています。

逆に、静的な平坦面または静的な溝を持つコントロールサンプルは、温度上昇後に再構成されません。この手順を行う際は、硬化チャンバーの形状、ポリマーの転移温度、歪み固定の方法、およびポリマー自体の組成をすべて調整することで、本手順に従い、自身の実験で目的とする転移を実現できることを念頭に置くことが重要です。基質からの機械的刺激に反応して遺伝子発現がどのように変化するかといった追加の問いに答えるためには、開発後にリアルタイムPCRなどの他の手法を用いることができます。

この手法により、細胞メカノバイオロジー分野の研究者が、細胞の細胞骨格、再編成、およびソフトマター物理学を2次元で調査することが可能になりました。私たちの研究に関心を持っていただき、またご視聴ありがとうございました。