Name: マイクロ波は、透過型電子顕微鏡による植物ウイルス病の迅速診断をアシスト (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぼう、マイクロ波アシストによる透過型電子顕微鏡を用いた植物ウイルス病の迅速診断法。従来法に比べ試料調製時間を大幅に短縮し、半日以内に明確な診断が可能となる革新的な手法です。

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この作品は、オーストリア科学基金（FWF、BZにP20619とP22988）によってサポートされていました。

マイクロ波アシスト試料調製<ol><li>試料調製1の開始は、電子顕微鏡のための自動マイクロ波組織プロセッサ（ライカEM AMWは、ライカマイクロシステムズ、ウィーン、オーストリア）をプログラムする必要があります前に、TEM用マイクロ波アシスト試料調製には、次のプロトコル（表1）： <img src="/files/ftp_upload/2950/2950table1.jpg" alt="表1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="表1"> 表1マイクロ波照射を用いた試料調製のためのプロトコル。別の列（左から右へ）表示： <ol><li>バイアル番号（ バイアル番号nr。）バイアルは、プロセッサのカルーセルにロードされる順序を表します。 </li><li>実際のプロセスのステップ。 </li><li>バイアル中の試薬。 </li><li>実際の工程の時間。 </li><li>マイクロ波照射が切れる前にバイアルに到達する最高温度。 </li><li>マイクロ波照射の設定：連続=急激な温度刻みASE、設定温度を保持する。スロープ=穏やかな温度上昇は、最後に到達した最終的な温度は、温度が5を落としてまで、パルス=急速な温度上昇、電源がオフになって℃、電源、温度に到達するために再開した。 </li><li>マイクロ波照射の最大電力。 </li></ol></li><li>たての試料調製プロトコル（寒天100エポキシ樹脂のため1.7を参照）で説明されているさまざまな手順のためのソリューションを用意し、プログラムされたプロトコル（表1）によると、指定バイアルにそれらを埋める、カルーセルにバイアルをロードしてから、INSERTマイクロ波組織プロセッサにカルーセル、最終的にモノモード室に最初のバイアルをロードします。 </li><li> 60MMソレンセンの3％グルタルアルデヒド（寒天サイエンティフィック（株）、スタンステッド、イギリス）のドロップでモデリングワックスプレート上にかみそりの刃でタバコモザイクウイルス（TMV）に感染したタバコタバコの葉の小さなセクション（1ミリメートル2）を切り取る室温でリン酸塩緩衝液（pH7.2）erature。 </li><li>約200μmのメッシュ幅は指定バスケットにすぐに細かいピンセットでセクションを転送します。互いの上にバスケットを積み重ねるとモノラルモードチャンバーに挿入してください。ケアは、サンプルは常に彼らが出て乾燥させないようにロードして、バスケットのスタッキングで固定液で覆われているように注意しなければならない。 </li><li>固定、脱水、浸透のために予めプログラムされたマイクロ波アシスト試料調製プロトコルを起動します。 </li><li>試料調製は、マイクロ波組織プロセッサによって自動的に実行されますが、第3条（ネガティブ染色）で説明したように、残りの植物材料とネガティブ染色を続行します。 </li><li>たての説明に従って、以下の成分を混合することにより寒天100エポキシ樹脂を準備します。フィル24グラム寒天100、16グラムドデセニルコハク酸無水物、及びプラスチックカップで10グラムメチルナジック酸無水物（すべてのコンポーネントの寒天科学（株）、スタンステッド、イギリスを参照）、熱をそれへの40℃とよく混ぜる。ベンジルジメチルアミン1.2グラムを加え、よく混ぜる。試料調製プロトコルは、エンド（表1のステップ22中など）に来る直前に指定された重合形に寒天100エポキシ樹脂を充填します。 </li><li>プロトコルが終了した後（表1のステップ22の後に）モノモード室からカルーセルの最後のバイアルの中に浸透したサンプルを含む積み重ねバスケットを離します。マイクロ波装置からカローセルを取り外し、バスケットのスタックを解除し、指定された重合形に細かいピンセットを使用してそれらをロードします。ケアは、サンプルは常に彼らが出て乾燥させないように、アンスタックとロード中に寒天100エポキシ樹脂で覆われていることを注意しなければならない。 </li><li>互いの上に重合フォームを積み重ねる。ケアは、サンプルは常に彼らが出て乾燥させないように積み重ね、ロード中に寒天100エポキシ樹脂で覆われていることを注意しなければならない。 </li><li>マイクロ波TISSのカルーセルから以前使用してバイアルを取り外しUEプロセッサは、積み重ねられたバスケットでそれをロードし、マイクロ波組織プロセッサにカルーセルを挿入します。 </li><li>あらかじめプログラムされた重合プロトコル（表1）を起動します。 </li><li>重合は、マイクロ波組織プロセッサによって自動的に行われているが、透過型電子顕微鏡でネガティブ染色グリッドを調べる[例えばフィリップスCM10、TEM、FEI社（旧フィリップス）、アイントホーフェン、オランダ]、セクション3と4（で説明したように画像解析を行うネガティブ染色と画像解析）。 </li><li>プロトコルスタック解除後モノモード室から重合形態、重合フォームを削除して、サンプルを含む重合ブロックを削除完了です。彼らは今、ミクロトームで切片化する準備が整いました。 </li></ol> 2。トリミングとセクショニング<ol><li>極薄のがホル​​ダーの外に約1cm上部に付着試料とセクショニングの個別のサンプルホルダーに1つ以上のブロックを挿入します。 </li><li>TEM（例えばライカライヘルトUltratrim、ライカマイクロシステムズ）の試料トリマーを使用してブロックを整えるように最大のブロック面。長さと（顔の大きさをブロックダイヤモンドナイフの大きさに調整する必要があります）を実現しており、できるだけ多くの葉材料を含んで幅200μmの中で1ミリメートル。 </li><li> 45°（例えばDiatomeウルトラ45、Gröpl、Tulln、オーストリア）のナイフの角度でダイヤモンドナイフを使用することにより、ウルトラミクロトーム（ライカマイクロシステムズなどライヘルトライカUltracut S）と節ブロックを。切片厚は約70〜90nmのに調整されるべきであり、切削速度は1mm / s程度である必要があります。 formvar（寒天サイエンティフィック（株））でコーティングされた銅やニッケル200平方メッシュグリッドを使用して複数のセクションを拾う。 </li><li>部分的に2フリーCOを作成するためのNaOHでいっぱいシャーレ内で5分間、クエン酸鉛（42ミリリットル再蒸留水と8ミリリットルを1N NaOHに溶解した1.1グラムクエン酸鉛寒天科学製）を用いてグリッド上のセクションを後染色環境と15マイルのための室温で蒸留水に溶解した1％酢酸ウラニル（寒天サイエンティフィック株式会社）とnutes。各ポスト染色工程の間に1分間蒸留水でグリッドを洗ってください。空気がグリッドボックスでグリッドを乾燥させてください。 </li><li>透過型電子顕微鏡（例えばフィリップスCM10、TEM、FEI社、アイントホーフェン、オランダ）を持つセクションを調べます。 </li></ol> 3。逆染色法<ol><li> TMV感染葉材料として100mg約収穫と60mmSøfrensenリン酸塩緩衝液（pH7.2）100μlの中で顕微鏡スライド上にかみそりの刃で2分のための材料を均質化することにより粗汁液を準備します。 </li><li> 4ウェル以上（あるいはそれはパラフィルムの一部にホモジネートを転送することも可能である）を持つテフロン顕微鏡スライドの最初のウェルに得られたホモジネート20μlのを転送します。 </li><li>ドロップおよびインキュベーションに向いformvar（寒天サイエンティフィック株式会社）コーティングされた側とのホモジネートの上formvarコーティングされたグリッドを配置5分間、それを脱灰する。 </li><li> 200μlの60MMソレンセンリン酸緩衝液（pH7.2）を2滴の上にグリッドを配置することによって、2分ごとにグリッド2回洗浄する。 </li><li> 60MMソレンセンリン酸塩緩衝液（pH6.5）中で新しく調製した2％リンタングステン酸（寒天サイエンティフィック株式会社）溶液で1分間グリッドをインキュベートする。 </li><li>グリッドを削除し、それがグリッドボックスで空気乾燥することができます。 </li><li>透過型電子顕微鏡（; FEI社、アイントホーフェン、オランダ例えばフィリップスCM10 TEM）でグリッドを調べます。 21000X以降の主な倍率での透過型電子顕微鏡を用いてランダムに選ばれたネガティブ染色したウイルス粒子の少なくとも10個のイメージが（少なくとも10以上ビリオンは各画像を表示する必要がある）を取る。ケアは、すべてのイメージが同じ倍率を持っていることを注意しなければなりません。 </li></ol> 4。画像解析<ol><li>から採取した顕微鏡写真で少なくとも100ランダムに選択された単一のウイルス粒子の長さと幅を測定ネガティブ染色試料を任意の画像解析用コンピュータソフトウェアを使用して[例えばセルD（オリンパス、生命およびマテリアルサイエンスヨーロッパGmbH、Hamburg、ドイツ）粒子分析ツールを使用してまたはOptimas 6.5.1-（Media Cyber​​netics社株式会社メリーランド州ベセスダ米国）]。 </li><li>ネガティブ染色法とTEMにより可視化したウイルス粒子の平均の長さと幅を達成するために、平均値と標準偏差を計算します。 </li><li>明らかにウイルス病を識別するために、文献で知られているウイルス疾患によって誘発されるウイルスおよび超微細構造変化の大きさと長さと微細構造の特徴を（2.5）で得られた比較。 </li></ol> 5。代表の結果： などのマイクロ波アシスト試料調製典型的なTMV誘起微細構造の変化の後に並列状に配列ビリオンを含む大きな領域は、感染した喫煙者のサイトゾルに透過型電子顕微鏡で観察することができたタバコ細胞（図1A）。さらに、TMVに感染葉の粗汁液でTMV粒子は負染色（図1B）の後屈曲、棒状構造として観察することができた。 100ウイルス粒子画像解析の幅が長さ17nmと280nmのである（図2）、TMVの平均サイズを明らかにした。 TMV感染細胞における超微細構造と本研究で観察されたビリオンのサイズはタバコと以前に文献9月15日に報告されたTMV粒子の大きさの範囲内で、TMV誘起微細構造の特性と一致していることがわかった。 <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> TMVに感染した葉の細胞およびビリオンの図1透過型電子顕微鏡写真。 a）画像は、マイクロ波アシスト植物試料調製後のタバコタバコのTMVに感染した葉肉葉細胞の超微細構造を示しています。細胞質に蓄積された平行に整列ビリオンの大面積に注意してください。でんぷんを使用したC =葉緑体（ST）、M =ミトコンドリア、核、N = V =液胞、バー=2μmの。 B）のイメージは、感染した葉の樹液でネガティブ染色により検出したビリオンを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2ビリオンの相対的な大きさ。彼らは電子顕微鏡で登場しましたように、負は、感染した葉の樹液を染色した後、TMV粒子の長さと幅の相対的な分布。 （長さ/幅の平均値±標準偏差）平均値は、100ビリオンから算出した。

<ol><li>Bozzola, J. J., Russell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JJ+%22Electron+Microscopy%22">Electron Microscopy</a>. , Jones and Barlett Publishers. Boston. (1999).</li>
<li>Kuo, J. Processing plant tissues for ultrastructural study. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuo%2C+J+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Electron+Microscopy%2C+Methods+and+Protocols%22">Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols</a>. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).</li>
<li>Schroeder, J. A., Gelderblom, H. R., Hauroeder, B., Schmetz, C., Milios, J., Hofstaedter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-assisted+tissue+processing+for+sameday+EM-diagnosis+of+potential+bioterrorism+and+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Microwave-assisted tissue processing for sameday EM-diagnosis of potential bioterrorism and clinical samples.</a> Micron. 37, 577-590 (2006).</li>
<li>Webster, P. Microwave-assisted processing and embedding for transmission electron microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+P+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Electron+Microscopy%2C+Methods+and+Protocols%22">Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols</a>. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).</li>
<li>Zechmann, B., Zellnig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+assisted+rapid+plant+sample+preparation+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Microwave assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy.</a> J. Microsc. 233, 258-268 (2009).</li>
<li>Lería, F., Marco, R., Medina, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+antigenic+preservation+of+plant+samples+by+microwave-enhanced+fixation%2C+using+dedicated+hardware%2C+minimizing+heat-related+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Micr.+Res.+Techniq%22%5BJournal%5D)">Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects.</a> Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).</li>
<li>Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+and+digital+imaging+technology+reduce+turnaround+times+for+diagnostic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrastruct.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy.</a> Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).</li>
<li>Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+polymerisation+with+microwave+irradiation+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Morph%22%5BJournal%5D)">Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy.</a> Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).</li>
<li>Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectric+spectroscopy+of+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1622, 57-63 (2003).</li>
<li>Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+force+microscopy+study+for+the+assembly+structures+of+tobacco+mosaic+virus+and+their+size+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation.</a> Langmuir. 13, 4150-4161 (1997).</li>
<li>Milne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplication+of+tobacco+mosaic+virus+in+tobacco+leaf+palisade+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells.</a> Virology. 28, 527-532 (1966).</li>
<li>Reunov, A. V., Gnutova, I. V., Lapshina, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tobacco+mosaic+virus+strains+on+the+ultrastructure+of+tobacco+leaf+parenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells.</a> Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).</li>
<li>Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., Fändrich, M., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+electron+microscopy+of+helical+specimens%3A+a+fresh+look+at+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus.</a> J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).</li>
<li>Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+tobacco+mosaic+virus+particles+as+scaffolds+for+display+of+protein+antigens+for+vaccine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications.</a> Virology. 348, 475-488 (2006).</li>
<li>Zechmann, B., Zellnig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+TEM+diagnosis+of+plant+virus+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases.</a> J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).</li>
<li>Giberson, R. T., Demaree, R. S. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+processing+techniques+for+electron+microscopy%3A+a+four-hour+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol.</a> Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

TEM用マイクロ波アシスト植物試料の調製は、数時間以内に3,4,16、高速かつ信頼性の高い超微細構造のデータを提供することが実証されています。本研究で使用した方法で達成小器官と膜の微細構造保持には、3日以上〜約2時間サンプルの固定と包埋時間の大幅な削減という利点を持つ5,15従来とcryofixedサンプルに類似していた。これは文学で現在利用可能なTEM用最速試料調製プロトコルを表します。本研究で述べた方法は、TMV誘起微細構造の変化およびウイルス剤自体の明確かつ迅速な同定を可能にしたネガティブ染色法とTEM用マイクロ波アシスト植物試料調製を組み合わせました。 TMVは超微細構造変化が電気伝送での固定の開始後約4時間以内に、トリミングセクショニングと後染色した後に調査される可能性が誘導されるトロン顕微鏡。完全自動試料作成モードを使用すると、ウイルス剤のサイズと幅を決定するために、暫定的にネガティブ染色を実施する研究者を解放した。したがって、私たちは、この方法は植物植物病理学における農業と科学的な実験では、将来の使用のために非常に重要である約半日での植物ウイルス病の明確かつ迅速な診断を可能と結論付けることができます。この方法はまた、動物とヒトの疾患の迅速な診断のために使用することができるとして、それは医療や獣医病理学の将来のアプリケーションのための大きな可能性を秘めています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/機器の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>寒天サイエンティフィック株式会社</td><td> R1312 </td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム</td><td>寒天サイエンティフィック株式会社</td><td> R1022 </td><td></td></tr><tr><td>寒天100樹脂</td><td>寒天サイエンティフィック株式会社</td><td> R1043 </td><td></td></tr><tr><td>ドデセニルコハク酸無水物</td><td>寒天サイエンティフィック株式会社</td><td> R1051 </td><td></td></tr><tr><td>メチルナジック酸無水物</td><td>寒天サイエンティフィック株式会社</td><td> R1081 </td><td></td></tr><tr><td>ベンジルジメチルアミン</td><td>寒天サイエンティフィック株式会社</td><td> R1060 </td><td></td></tr><tr><td>クエン酸鉛</td><td>寒天サイエンティフィック株式会社</td><td> R1210 </td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td>寒天サイエンティフィック株式会社</td><td> R1260A </td><td></td></tr><tr><td>リンタングステン酸</td><td>寒天サイエンティフィック株式会社</td><td> R1213 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar </td><td>寒天サイエンティフィック株式会社</td><td> R1202 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td>ライカEM AMW </td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ（ライヘルト）Ultratrim </td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td></td><td>新しいモデルが利用可能です</td></tr><tr><td>ライカ（ライヘルト）Ultracut S </td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td></td><td>新しいモデルが利用可能です</td></tr><tr><td> Diatomeウルトラ45 </td><td> Gröpl </td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィリップスCM10、TEM </td><td> FEI社（旧フィリップス） </td><td> &lt;/ TD&gt; <td>新しいモデルが利用可能です</td></tr><tr><td>セルD </td><td>オリンパス株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Optimas 6.5.1 </td><td>メディアサイバネティックス株式会社</td><td></td><td>新しいバージョンが利用可能です</td></tr></tbody></table>

マイクロ波は、透過型電子顕微鏡による植物ウイルス病の迅速診断をアシスト

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

ウイルスによって誘発される超微細構造変化の調査は、しばしば明確植物におけるウイルス性疾患を識別する必要があります。透過型電子顕微鏡（TEM）のための従来の試料調製とそのような調査は数日間1,2を取ることができ、したがって、植物ウイルス病の迅速診断には適していません。マイクロ波固定が大幅に従来の試料調製3月5日後に観察されたと同様の超微細構造のTEM観察結果と調査のためのサンプル調製時間を削減するために使用することができます。さまざまなカスタムメイドのマイクロ波デバイスは、成功した固定およびTEM調査5-8生物試料の埋め込 ​​みに使用することができる現在利用可能です。本研究において、我々は、それがTのためのマイクロ波アシスト試料調製を使用して約半日で葉の微細構造の変化を診断することが可能であることをタバコモザイクウイルス（TMV）感染タバコタバコ植物に実証EM。それは多くのステップがまだ手動で6月8日に実行されなければならないため、より多くの時間と労力を消費している他の利用可能なデバイスとは対照的に、ほぼ完全に自動的に5試料調製を行いますので、我々は市販のマイクロ波デバイスと、この研究を行うことを選択しました。サンプルの準備が完全に自動的に行われるように、残りのTMV感染葉や超微細構造およびサイズ​​は、次の検査の樹液でウイルス粒子の負染色は固定と包埋時に行うことができます。

本研究では、透過型電子顕微鏡と負染色法のためのマイクロ波アシスト植物試料調製の組み合わせを使用して約半日での植物ウイルス病の迅速かつ明確な診断を可能にする方法を説明します。

植物におけるウイルス病を明確に特定するためには、ウイルスによって誘導される超微構造の変化を調査することがしばしば不可欠である。従来の試料...

本手順の全体的な目的は、透過電子顕微鏡を用いて数時間以内に植物ウイルス病を診断することです。この手順は、まず感染した植物試料のマイクロ波補助固定および包埋から始まります。次のステップとして、ネガティブ染色により植物サンプルからウイルス粒子を抽出し染色し、続いて包埋した植物サンプルの切片作成を行います。その後、透過電子顕微鏡でサンプルを観察し、画像解析によってウイルス粒子のサイズを測定します。最終的に、透過電子顕微鏡法により、ウイルスによって誘発された典型的な超微形態学的変化とウイルス粒子のサイズが示されます。数日かかることもある室温での従来の固定および包埋などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、透過電子顕微鏡用のサンプル調製時間を約2時間に短縮できることであり、これにより約半日でウイルス性疾患の明確な診断が可能になります。この手順を私と共に実演するのは、技術者のGerhard Kaba氏と、当研究室の同僚であるZelnik教授です。サンプル調製プログラムを開始する前に、電子顕微鏡用自動マイクロ波組織処理装置LA A-E-M-A-M-Wに適切なプロトコルを設定してください。プログラムされたプロトコルに従い、固定、脱水、および浸透の各ステップに使用する溶液を調製し、指定のバイアルに充填してカルーセルにセットしてください。カルーセルをマイクロ波組織処理装置に挿入し、最初のバイアルをモノモードチャンバーにロードしてください。次に、タバコモザイクウイルス（TMV）に感染したタバコ（Nicotiana tabacum）の葉から、室温でグルタラルデヒド含有ソレンゼン・リン酸緩衝液の一滴を用い、モデリングワックスプレート上でカミソリを用いて小さな切片を切り出します。サンプルの採取およびバスケットへの充填時には、サンプルが乾燥しないよう、常に固定液に浸っていることを確認することが重要です。精密ピンセットを用いて、切片を速やかに孔径約200 µmの指定のバスケットに移します。バスケットを互いに積み重ね、モノモードチャンバーに挿入します。事前にプログラムした、固定、脱水、および浸透のためのマイクロ波支援試料作製プロトコルを開始します。試料作製プロトコルの終了直前に、調製したばかりのagar 100エポキシ樹脂を、指定の重合用型に充填します。プロトコル終了後、浸潤させたサンプルが入ったスタックバスケットを、モノモードチャンバーからカルーセルの最後のバイアルへ放出します。マイクロ波装置からカルーセルを取り出し、サンプルが入ったバイアルをカルーセルから取り出します。その後、バイアルからバスケットを取り出し、精密ピンセットを使用してスタックを解除してください。サンプルを所定の重合用フォームに充填します。次に、重合用フォームを重ね合わせ、マイクロウェーブ組織処理装置のカルーセルから既に使用済みのバイアルを取り除きます。重ねたバスケットをカルーセルにセットし、カルーセルをマイクロウェーブ装置に挿入します。あらかじめプログラムした重合プロトコルを開始します。プロトコルの終了後、モノモードチャンバーから重合用フォームを取り出し、重ね合わせを解除します。サンプルを含む重合ブロックを取り出します。これで、サンプルを含むブロックをマイクロトームで切断する準備が整いましたので、切片作成の手順を開始してください。超薄切片作成のため、1つまたは複数のブロックを別々のサンプルホルダーに挿入します。サンプルを上に向け、ホルダーから約1cm突き出すようにします。TEM用試料トリマーを用いてブロックをトリミングし、可能な限り多くの葉の組織を含む、最大で長さ1mm、幅200µmのブロック面を作成します。ウルトラミクロトームを、切削速度を約1 mm/sに設定し、切片の厚さが約70～90 nmになるように調整します。ナイフ角度45度でダイヤモンドナイフを用いてブロックを切削します。Formvarコートされた銅またはニッケルの200メッシュグリッドを用いて複数の切片を回収し、CO2のない環境を作るためにNaOHを部分的に満たしたペトリ皿の中で、鉛 citrate を用いて5分間グリッド上の切片を後染色します。グリッドを蒸留水で1分間洗浄します。最後に、グリッドを蒸留水で1分間洗浄した後、室温で蒸留水に溶解した1%酢酸ウラニル溶液を用いて15分間後染色し、グリッドボックス内で風乾させます。マイクロ波組織処理装置によるサンプル調製が自動的に行われている間に、残りの植物試料のネガティブ染色を実施します。まず、TMVに感染した葉の組織を約100 milligrams回収し、顕微鏡スライドグラス上でカミソリを用いて2分間均質化させ、粗抽出液（SAP）を調製します。この際、ソレンゼンおよびリン酸緩衝液を用います。得られた均質化液20 microlitersを、テフロンコーティングされた顕微鏡スライドの最初のウェルに転移させます。4ウェル以上のスライドを使用します。次に、Form VARコーティングを施したグリッドの、コーティング面を液滴に向けてホモジネートの上に置き、5分間インキュベートします。その後、グリッドをソレンゼンリン酸緩衝液の液滴の上に置き、2分間洗浄します。さらに2分間、洗浄を繰り返します。次に、新しく調製したphospho tongue stick酸溶液を用いて、グリッドを1分間インキュベートします。1分後、グリッドを取り出し、風乾させます。グリッドボックスに入れ、ネガティブ染色したグリッドをサンプルホルダーに装着し、透過電子顕微鏡で観察します。マイクロ波組織プロセッサーで重合を自動的に行っている間に、ランダムに選択したネガティブ染色のイオンの画像を少なくとも10枚撮影してください。各画像には、少なくとも10個以上のイオンが写っている必要があります。透過電子顕微鏡を用いて一次倍率21,000倍以上で観察する場合、すべての画像が同一の倍率になるよう注意する必要があります。マイクロ波組織処理装置で自動処理された組織サンプルを含む切片についても、透過電子顕微鏡を用いて検査します。TEMで取得した画像の解析は、任意の画像解析ソフトを用いて行うことができます。粒子解析ツールを備えたコンピューターソフトウェアを使用します。ネガティブ染色サンプルから撮影した顕微鏡写真において、ランダムに選択した少なくとも100個の単一ウイルス粒子の長さとサイズを測定します。平均値と標準偏差を算出し、マイクロ波支援試料調製後のネガティブ染色法およびTEMによって可視化されたウイルス粒子の平均的な長さと幅を求めます。感染したタバコ（Nicotiana tobacco）細胞の細胞質を透過電子顕微鏡で観察したところ、並行に配列したイオンを含む広範な領域など、典型的なTMV誘発性の超微形態的変化が認められました。この透過電子顕微鏡写真において、Cはデンプンを含む葉緑体、St.Mはミトコンドリア、isは核、Vは液胞を表しています。さらに、TMV感染葉の粗抽出SAPにおいて、ネガティブ染色後、TMV粒子が棒状の構造として観察されました。図1B。このグラフは、電子顕微鏡で観察された100個のTMV粒子の長さと幅の相対分布を示しています。ネガティブ染色後の感染葉のSAPにおけるウイルス粒子の画像解析により、TMVの平均サイズは長さ280 nanometers、幅17 nanometersであることが明らかになりました。これにより、ウイルス病を迅速に診断する手法が開発されました。この技術は、動物およびヒトの病理学分野の研究者が、透過電子顕微鏡を用いて動物およびヒトの疾患を迅速に診断するための道を開く可能性があります。

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JoVE Journal

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学ぼう、マイクロ波アシストによる透過型電子顕微鏡を用いた植物ウイルス病の迅速診断法。従来法に比べ試料調製時間を大幅に短縮し、半日以内に明確な診断が可能となる革新的な手法です。

マイクロ波は、透過型電子顕微鏡による植物ウイルス病の迅速診断をアシスト

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