嗅神経細胞のレンチウイルスを介した遺伝子操作と可視化 in vivoで

神経科学における発生研究の課題の1つは、in vivoで単一の細胞レベルで樹状突起と軸索の形態を捉えることです。嗅覚系では、嗅覚ニューロンは鼻の嗅上皮から脳の嗅球まで軸索を伸ばしています。複数の嗅覚ニューロンが嗅球に向かって突出すると、それらは束になります。

これは、個々の軸索の軌跡とその末端形態の研究を複雑にします。私たちは、A GFPコンストラクトをマイクロインジェクションすることにより、in vivoで単一の嗅覚ニューロンを可視化する方法を開発しました。レンチウイルスをベアリングします。

レンチウイルスによる形質導入が成功すると、末端のアーバーを含む嗅覚軸索全体の長さが照らされます。この手法では、単一の嗅覚ニューロンを可視化するだけでなく、特定の対象遺伝子の遺伝子発現を操作して、in vivoでのその機能を研究することができます。このレンチウイルス手順はバイオセーフティレベル2であり、層流フードで実行する必要があります。

無菌環境を維持するために、フードに挿入されたすべてのものにフード内の70%エタノールをスプレーし、37度のウォーターベッドを少なくとも20分間準備して予熱します。注射前。水で半分満たされたプラスチック製の収納袋を密封し、空の加熱ブロックインキュベーターに置きます。

これにより、マウスは注射後に回復することができます。バイオハザード廃棄物容器に10%漂白剤を充填し、ウイルスに曝露されたすべての物質を除染します。この手順から、70%エタノールの小さなオープンディッシュと滅菌蒸留水で2番目のディッシュを準備します。

層流フードでは、5マイクロリットルの容量のハミルトンシリンジと33ゲージの針を使用します。この特定のモデルでは、プランジャーチャンバーの上部にあるテンションダイヤルを回すことでプランジャー抵抗を調整できます。この機能により、針とシリンジチャンバーを滅菌するためのマイクロインジェクション容量制御が可能になります。

エタノールを皿から数回吸引して排出することを繰り返します。滅菌水を数回吸引して排出することにより、シリンジカートリッジをすすぎます。シリンジをフローフードに安全に置きます。

注射ステーションの近くにアルコールワイプを配置します。マウスの位置決めを容易にする隆起した表面を提供する注入ステージを準備します。キムワイプで覆われた逆さ10センチの培養皿を使用できます。

マウスの子犬は、離乳期まで低体温症で麻酔をかけることができます。ゴム手袋の指を切り取り、マウスの子犬を指の切断に置きます。その後、氷の上に5分間置きます。

手袋は、動物が反応しないように子犬の後肢と4本の足をつまむことにより、徹底的な麻酔のための氷テストとの直接皮膚接触から発生する皮膚の火傷を防ぎます。これで、レンチウイルスのマイクロインジェクションの準備が整いました。新生児の子犬と一緒にデモンストレーションを行います。

古い年齢のマウスを使用する場合は、頭蓋骨の表面を貫通するために、33ゲージの針をより太いゲージの針に置き換える必要があります。マウスの鼻の表面をアルコールパッドで拭いて滅菌します。レンチウイルスストックを冷凍庫から取り出し、氷上で解凍します。

私たちは、確立された方法を使用して、実験室でレンチウイルスを自分たちで製造しました。この方法を開発するにあたり、良好な形質導入率を得るためには、1milあたり10〜9の感染単位の最小ウイルス力価が必要であることがわかりました。滅菌したハミルトンシリンジに2マイクロリットルのレンチウイルスストック溶液を吸引します。.

マウスの子犬を注入ステージの上に置きます。頭のてっぺんの耳のところの皮膚をつかみ、そっと引き戻します。フローフードには解剖スコープを装備しました。

マイクロインジェクションを正確に指示するためには、前脳の背側頭蓋骨表面で嗅球の輪郭を探します。当社のマイクロインジェクションターゲットは、嗅球を密接に取り囲んでいますが、嗅球自体を含めるべきではありません。各子犬の嗅上皮に4回の注射を行います。

青い点で表されるこれらの位置では、針を内側を向いた角度で挿入する必要があります。緑色の点で表される追加の 2 つの注射は、嗅球の内側と前方にずらして配置されています。これらの注射は、ゆったりとした角度にすることができます。

針の角度の提案は、主に嗅球の下に位置する嗅上皮の腹側位置を考慮して行われます。したがって、垂直アクセスは制限されます。皮膚表面から約3mm下の鼻腔の上部から針を挿入します。

嗅上皮に到達するため。訓練を受けた手は、鼻腔の内腔に達したときに抵抗の低下を感じるはずです。このエリアは避けるべきです。

位置ごとに0.5マイクロリットルのウイルスストック溶液をマイクロ注入します。ここでも、左右両側に2つのサイトを選択し、合計0.5マイクロリットルの4回の注射を行います。1匹のマウスは、1回の注射セッションで1匹のマウス2マイクロリットルのウイルスが必要だということです。

繰り返しになりますが、嗅球ブロットを注入して、注射部位や鼻孔の開口部から逃げる可能性のある残留ウイルス溶液や血液を乾燥させないように注意してください。エタノールワイプを使用して、希釈した液体漂白容器にワイプを廃棄し、注入したマウスをすぐにウォーターベッドインキュベーターに置いて回収します。調製中に行われる滅菌手順を繰り返してニードルシリンジを除染する 注射されたマウスは、ウォーターベッドインキュベーターで回復してから30分後にケージに戻すことができます。

このマイクロインジェクション全体は、4時間で再度繰り返すことができます。感染する嗅覚ニューロンの数を増やしたい場合、感染した嗅覚ニューロンは、わずか3日で細胞の全長にわたって視覚化される可能性があります。動物は、目的の時点で観察するために犠牲にされ、灌流されました。

標準的な方法を使用して、形質導入された単一細胞の嗅覚ニューロンの軌跡と軸索末端を視覚化するために、60ミクロンの厚さで嗅球冠状動脈を解剖し、切片化します。したがって、このセクションには、嗅覚ニューロン軸索束、および浮遊免疫組織化学の準備として球根表面に結合した糸球体構造でシナプスを形成する軸索終末を含む、嗅球のすべての細胞層が含まれます。嗅球の連続切片を作製し、5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水を含む10センチメートルの培養皿にまとめて掃きます。

フローティングセクションを50ミリリットルの円錐形バイアルに移します。切片がバイアルの底に落ち着いたら、リン酸緩衝生理食塩水を真空で取り除きます。掃除機をかけないように注意してください。

切片には10ミリリットルの新鮮なバッファーが補充され、残留した固定剤や包埋材を洗い流すことができます。すぐにこの再懸濁液を15ミリリットルの円錐形バイアルにピペットで移し、すべての浮遊切片を捕捉し、すすぎ液を真空引き落とし、0.3%Triton X 100の溶液で切片を穿孔し、リン酸緩衝生理食塩水に10分間ロッカープラットフォームに置きます。室温では、同じコニカルバイアルで標準的な免疫染色プロトコルを進め、このサイズの容器で必要に応じて真空ステップとロッカーステップを繰り返し、染色およびすすぎステップのために10ミリリットルの容量を保持することができます。

これは、陽性で形質導入された嗅覚ニューロンと一般的な嗅覚ニューロン集団を染色するために使用する抗体のリストです。60ミクロンの球根切片に抗体を完全に浸透させるためには、摂氏4度で一晩インキュベートすることをお勧めします。また、洗濯の深さはそれぞれ20分以上でなければなりません。

ペイントブラシでスライドガラス上の各セクションを静かに広げ、各スライドにクロマチンステイン溶液を補充したフローラマウントGを取り付けます。封入剤からすべての気泡を除去する努力をしてください。セクションを行にマウントして、後続のスクリーニングステップを簡素化します。

免疫染色球片のこれらの層をスキャンして、GFP陽性軸索繊維と末端を探します。蛍光顕微鏡を使用して、陽性に感染した神経終末を共焦点顕微鏡で画像化できます。DPIおよび嗅覚マーカータンパク質チャネルを使用して、関心のある領域の焦点面を較正すると便利です。

これらの結果は、糸球体内の単一の嗅センサーニューロン軸索線維と軸索終末を示しており、これは赤の嗅覚マーカータンパク質と灰色のvlu 2の嗅覚マーカータンパク質を持つCOであり、この組織が解剖および免疫染色ステップに含まれていれば、それらの樹状突起ノブも嗅上皮内で視覚化できます。こんにちは、私の共焦点投影は、単一の嗅覚ニューロン軸索伸展経路と末端アーバーの非常に詳細な形態を私たちに提供します。軸索線維が糸球体標的に戻るのと、糸球体神経ピル内の分岐パターンの詳細を見ることができます。

レンチウイルスマイクロインジェクション法は、単一細胞軸索、嗅覚ニューロンの形態の可視化を可能にし、遺伝子発現を操作する研究を可能にし、レンチウイルス形質導入はコンストラクトの安定したゲノム統合をもたらします。レンチウイルスは、隣接する細胞にシナプス性トランス感染しません。視覚化はわずか3日で達成でき、少なくとも3か月続くことが確認されており、おそらく長期間持続する可能性があります。

嗅覚ニューロンは、レンチウイルス溶液の鼻腔注入によって容易に感染しません。したがって、この手順では、表面を介したマイクロインジェクションが必要です。以上がレンチウイルスマイクロインジェクションの手順です。

私はあなたがあなた自身のハッピーハンティングの単一細胞形態を達成するために、このすべての情報が役立つことを発見したことを願っています。