Name: 大人の準備ショウジョウバエアイズ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学ぶ大人のショウジョウバエ眼の半薄切片作成と顕微鏡解析法。エポキシ樹脂包埋とダイヤモンドナイフを用いたミクロトーム切片により、変異体の眼表型や遺伝的相互作用を詳細に評価できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私は図の写真のために博士ジェニファーカーチスを感謝したいと思います。批判的に原稿を読み取るための1とジェレミーフェイガン博士フィレンツェマーロウ。私たちの活動は、NIHの助成金1R01GM088202によってサポートされています。

1。頭部の解剖を飛ぶ<ol><li>あなたが手ですべての材料を（ゼラチンコートしたスライドを含む）があることを確認してください。グルタルアルデヒドとオスミウム固定液を準備します（下記参照）。氷の上で1.5 mlチューブに、アリコート200μlのグルタルアルデヒドの修正ソリューションを埋め込むことが遺伝子型ごと。 </li><li> CO 2パッドの上にハエを麻酔（我々は通常一頭の手順の実行中に破壊される場合には遺伝子型ごとに6を埋め込 ​​むための7つのハエの頭を解剖する）。 </li><li>ホールドとわずかにフライの胸部を押すと、背側を上に、ピンセットで、頭部を切断する鋭いメスを使用してください。 </li><li>ピンセットで首を触れることによってフライヘッドを安定させ、慎重に片目の小さな部分をそぎ落とす。これは、固定液の浸透を高めます（あなたがクローン解析のためにあなたの目のセクションを使用する場合は、noまたは小さいクローンで目をカット）。後で区分けとなる無傷の目に触れないし、損傷を避けること。 </li><li>目カットオフの表面にピンセットまたはメスの頭を触ると（固定液の上に浮かぶ多くの場合、ヘッド）氷の上にグルタルアルデヒド/リン酸固定液中に頭を転送解剖ヘッドが長くグルタルアルデヒドの修正に保管すべきではないオスミウムを添加する前に15分以上。同じ遺伝子型の他のハエと手順1.2から1.5を繰り返します。 </li></ol> 2。固定と包埋（すべてのステップのために手袋を使用！） <ol><li> 10,000 rpmで1分間エッペンドルフ遠心分離機でflyheadsを回転させる。ヘッドがシンクしていない場合でも、引き続き。 </li><li> OSO 4溶液200μlのを追加し、少なくとも30分間、氷上で1時間までのために修正。 </li><li>パスツールピペットを使用して、グルタルアルデヒド/オスミウム液（廃棄物の適正処理の手順を使用することを確認してください！）削除し、200μlのオスミウム溶液を交換してください。 1から6時間氷上でインキュベートする。常に頭が完全に液体で覆われていることを確認し、頭や目が崩壊する可能性があるので、ソリューションのすべてを削除することはありません！ </li><li>パスツールピペットを使用して、氷の上に少なくとも5分（エタノール以来、廃棄物の適正処理の手順を使用することを確認して今オスミウムを含む！）のために0.5〜1ミリリットルの30％エタノールとインキュベートを追加、固定液を捨てる。 </li><li> 50％、70％、（80％）、90％と倍の100％エタノールで上記の手順を繰り返します。電子顕微鏡分析のために目を使用する場合は80％エタノールのステップが含まれています。 70％の洗浄ステップの後、サンプルを氷上から削除することができます。 </li><li>プロピレンオキサイド（揮発性、フード内で作業を続行）、同量のエタノールを交換してください。室温で10分間インキュベートする。 </li><li>酸化プロピレンの洗浄を繰り返します。酸化プロピレンの蒸発による目の崩壊を避けるために並行して多くの遺伝子型を処理する場合のバッチで動作します。 </li><li>プロピレンオキサイドのソリューション：酸化プロピレンの大部分を除去し、プラスチック製のトランスファーピペットを使用しては、1:1の樹脂の500μL程度加える。一晩室温で平衡化させます。 </li></ol> 3。金型の埋め込みと配置<ol><li>すべての金型をお使いの異なる遺伝子型を追跡するためにラベルが付いていることを確認し、100％の樹脂と金型を埋める。オーバーフィル（金型の表面を横切ってまっすぐ見て、金型の表面上にない"高丘"）しないでください。電磁界解析のための硬質樹脂を使用してください。 </li><li>転送ピペットを使用して、頭から50％の樹脂を除去する、100％の樹脂と置き換えると、室温で3-4時間インキュベートします。ヘッドは樹脂を浸透しているとして、彼らはチューブの底に沈むだろう。 </li><li>少しフックを作成するために一度、ハード面に到達したつまようじを使用して、金型内に一度頭を転送する。 </li><li>樹脂の流出から保護するために、解剖範囲の作業領域にアルミ箔を置きます。 </li><li>解剖針を使用し、樹脂で、スコープ、スワール少し頭も探して、慎重に先の尖った端に近い金型の底部に移動します。 </li><li>慎重に目の接線面が約半分に頭に注意しながら、金型の正面の壁にそのまま（！）目（またはあなたが断面を持つようにしたい場合はあなたの将来のセクショニング面）首の表面を下に揃える離れて鋳型壁から直径。まれに、眼の表面とヘッドのキューティクルの間に空の空間として見ることができる眼の崩壊。折りたたま目を持っている場合、 第 7 回スペア目でそれを置き換えます。 </li><li>すべてのヘッドを繰り返します。一度にすべての位置揃えを行うには、樹脂製の針を取り外したときに彼らが動いていないと確認するためにすべての目を再度確認してください。 </li><li>あなたが解剖針を取り除くときに移動するの目に問題がある場合は必要に応じて、目の位置を、すぐに少し離れて頭から針を収納してから、ゆっくりと完全に針を取り除く。 </li><li> 70℃一晩金型を焼く℃に</li></ol> 4。トリミングとセクショニング<ol><li> K、金型を曲げることで金型から硬化したブロックを削除します。ブロックがどの遺伝子型（小型のシンチレーションバイアル内など店舗）に対応するかを追跡しeeping。 </li><li>トリミングのために、プレキシグラスやアルミのブロックに表向きにマウントされているあなたのミクロトーム用の適切なチャックを使用してください。チャックでトリミングするブロック、上の目を、マウントします。 </li><li>テフロンコーティングされたかみそりを使用して解剖スコープの下で、あなたのブロックの唯一の最上位層を遮断、命じた。これは、目を見てくださいので、切片の将来の平面を予測できるものの明確な面を残す。あなたの指を切断しないでください！ </li><li>ヘッド周りのプラスチックのほとんどが切断されるまで（つまり、目を整列するときに金型の上部に分かれていたもの）頭の両側に、前面の余分なプラスチックを切り取ります。徐々にプラスチックの複数の薄い層を切断して頭部に近づくことが最良です。 </li><li> 、きれいなカミソリの刃を使用して慎重に後のセクションにする正確な平面で目の上から薄い層を削除する（通常は接線方向に眼に、オリジナルの金型の表面に少し角度）。 </li><li>あなただけの目の外側の表面を切り取るために開始されるまで続けます。あなたがミクロトームのアライメントが容易に輝く、透明な表面を、取得するためにブレードのクリーンエリアを使用するようにしてください。 </li><li>カミソリの刃で保存するには、ブロックの側面のまわりトリミング原油のための古いブレードを使用し、（最初のカットと4.6）トリミング罰金のための新たなブレードを使用してください。最後に、あなたの将来の断面平面に相当するわずかに傾いた、カットオフトップの3つの角錐を持つことになります。 </li><li>ミクロトームでブロックをマウントします。実際の切片はミクロトームの種類によって異なり、ここでは詳しく説明されません。我々は、0.5〜1μmのセクションをカットするヒストグラムの品質のダイヤモンドナイフでソーバルMT5000を使用してください。光学顕微鏡分析のために、切片厚のわずかな変化は重要ではありません。セクショニングのクローンが白+遺伝子、セクションによってマークされていれば、1μm以下のセクションでは、セクションごとにrhabdomeres（図2）に隣接する十分な色素顆粒を持って確保する。 </li><li>のセクションでは、水に浮くでしょう。回転運動での水面下から木製のQ -ティップの平坦化されたエンドを持つ最初の20から30のセクションを持ち上げて、ゼラチンコートしたスライドガラス（約100℃で加熱プレート上に保持に水の滴にそれらを転送する）。 </li><li>別の20から30までのセクションで繰り返します。水が蒸発したとの項では、スライドに付着されるまで待ちます。通常、3眼のセクションでは、あるスライドにうまく収まるタウンシップの行によってつの列（3眼）（上部/下部のセクション）に配置。 </li></ol> 5。染色および顕微鏡分析<ol><li>クローンをセクショニングの場合を除き、セクションを染色。 90設定された加熱ブロック上のセクションを持つ場所のスライド℃のスライド上に0.22μmフィルターに接続された30mlのシリンジからトルイジンブルーの染色液を分注し、10秒間染色。すぐに蒸留水で広範囲にすすいでください。空気乾燥した。 </li><li>プラスチック製のトランスファーピペットを用いて、スライド上にメディアをマウントするDPXの3滴を配布し、カバースリップでカバーしています。 3セント硬貨でトップとマウンティング培地硬化（室温で例えば一晩）ができます。 </li><li>光学顕微鏡と画像。良いセクションを検索し、詳細な分析と撮影用63x油浸レンズに切り替えるために5倍または10倍レンズを使用してください。我々は、通常、位相コントラスト設定を使用しますが、暗視野光学系も同様に動作する。 </li></ol> 6。代表的な結果： 最も頻繁に、目は遺伝学的スクリーニングの一部として、または一般的な眼の構造や極性のどちらかに影響を及ぼすことが知られている遺伝子との遺伝的相互作用をテストするプロセスで検出された外部険しい目の表現型の詳細な分析のためのプラスチックに埋め込まれています。目のセクションの代表的な結果を図3に示されています。野生型ommatidiumの複数形（図3A）は、色素細胞の格子に囲まれた完全な光受容体の補数を示しています。対照的に、 斜視（stbm、別名バン-ゴッホ7）変異体では、ommatidial極性がフル光受容体の補数が存在しているのにもかかわらず、失われたとされ、回転とキラリティーは、無作為化した（図3B）です。さらに、切片stbm対立遺伝子は、AWのころから-背景、顔料顆粒は、図に欠けています。 3B。図3Cは、クローン解析の例を示しています。 ショウジョウバエ Rhoキナーゼ（DROK）が目8の構造的完全性のためだけでなく、ommatidial回転に必要とされる。野生の変異-ホモ接合DROK 2クローンは色素細胞とrhabdomeres（通常は中の顔料の有無によって識別することができる、クローンが目のない - FLPと背景のwを補完強く発現して白いマーカー遺伝子を持つP -エレメントを使用して誘導される型およびヘテロ接合組織）。それは色素の欠如により、変異体領域を識別することが可能である。 R - CEにおける色素沈着の細胞自律性に起因するLLSは、前述したように、個々のR -細胞の遺伝子型は（図3Cの矢印を参照）を決定することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 野生型の目（）の滑らかな表面とは対照的に、変異体眼の表面は目の表現型の根底にあることを示し、（B）外部から頻繁に荒いです、ので、 図1。 ショウジョウバエの眼は、生物学者のための優れたモデルシステムである。すべての図では、前方は左にあり、背側は最高です。博士ジェニファーカーチス、NMSU、エルパソ、テキサス州、米国の画像の礼儀。 <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2に記載の方法を使用して区分単ommatidiumの複数形の光学顕微鏡像。わずか7 R -細胞は、R8の上にR7嘘以来、個眼ごとに一度に表示されます。 （、'）（R7レベルでは、R7の細胞体は、R1とR6の黄色の矢印）との間で検出される"。対照的に、R8のレベル（B）で、R8の細胞体は、R1とR2（B'の黄色の矢印）との間で検出される。青い矢印は細胞自律的な顔料のマーカーとして使用できる顔料の顆粒をマーク。 <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。野生型（）、stbm（B）とDROK（C）変異大人ショウジョウバエのような目でタンジェンシャルセクション。セクション下の回路図はommatidiumの複数形の極性を（矢のために（A）参照）を示します。円は、感光体の補数の欠陥でommatidiumの複数形を表しています。黄色の線は、対称性（赤道）の背側/腹側のラインを表す。 （）野生型のよく指向ommatidiumの複数形とは対照的に、平面組織はstbm変異体（B）に失われます。変異体背景-示さstbmの変異体のセクションは、そのwに起因する色素を欠いていることに注意してください。 DROKの変異は致死的であるので、（C）、彼らはクローンで分析する必要があります。顔料（オープン青い矢印）を欠いているR -細胞間にこのように、色素細胞が、（青色の矢印を充填）、野生型またはヘテロ接合体であるホモ接合変異体である。回転の欠陥に加えて、DROK変異体はまた、R -細胞の欠落または過剰な数字を含めて構造的な欠陥を示しています。クローン解析のために、セクションでは顔料の粒剤を不明瞭にしないために染色されないことに注意してください。

<ol><li>Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Mst+ortholog%2C+hippo%2C+restricts+growth+and+cell+proliferation+and+promotes+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis.</a> Cell. 114, 457-457 (2003).</li>
<li>Secombe, J., Li, L., Carlos, L., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Trithorax+group+protein+Lid+is+a+trimethyl+histone+H3K4+demethylase+required+for+dMyc-induced+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Trithorax group protein Lid is a trimethyl histone H3K4 demethylase required for dMyc-induced cell growth.</a> Genes Dev. 21, 537-537 (2007).</li>
<li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Drosophila+eye+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of Drosophila eye differentiation.</a> Curr Top Dev Biol. 89, 115-115 (2009).</li>
<li>Jenny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 189-189 (2010).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+in+the+Drosophila+Ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fate in the Drosophila Ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-264 (1987).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 120, 366-366 (1987).</li>
<li>Jenny, A., Darken, R. S., Wilson, P. A., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle+and+Strabismus+form+a+functional+complex+to+generate+a+correct+axis+during+planar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Prickle and Strabismus form a functional complex to generate a correct axis during planar cell polarity signaling.</a> Embo J. 22, 4409-4409 (2003).</li>
<li>Zheng, L., Zhang, J., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((frizzled+regulates+mirror-symmetric+pattern+formation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">frizzled regulates mirror-symmetric pattern formation in the Drosophila eye.</a> Development. 121, 3045-3045 (1995).</li>
<li>Reinke, R., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interaction+in+the+Drosophila+Retina%3A+The+bride+of+sevenless+Gene+is+required+in+photoreceptor+cell+R8+for+R7+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interaction in the Drosophila Retina: The bride of sevenless Gene is required in photoreceptor cell R8 for R7 cell development.</a> Cell. 55, 321-321 (1988).</li>
<li>Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((strabismus%2C+a+novel+gene+that+regulates+tissue+polarity+and+cell+fate+decisions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">strabismus, a novel gene that regulates tissue polarity and cell fate decisions in Drosophila.</a> Development. 125, 1149-1149 (1998).</li>
<li>Winter, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rho-associated+kinase+%28Drok%29+links+Frizzled-mediated+planar+cell+polarity+signaling+to+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rho-associated kinase (Drok) links Frizzled-mediated planar cell polarity signaling to the actin cytoskeleton.</a> Cell. 105, 81-81 (2001).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1223 (1993).</li>
<li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStocker%2C+H+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. Dahmann, C. 420, Springer. 27-27 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

モデル生物、ヒトを含む高等真核生物で高度に保存されたシグナル伝達経路のほとんどのための必須遺伝子ファミリーの創立メンバーの多くが同定された遺伝子スクリーニングとしてショウジョウバエを用いた。 、実験室条件下​​で、機能的な目は生存のために不要なので、目には、新たな遺伝子機能の発見と遺伝子ネットワークの評価に特によく適し組織です。記載された方法を用いてフライアイの超微細構造解析は、このように開発し​​、疾患に関連する基本的な発見につながった。最初に、単一細胞クローン分析が知られている密接に関連する細胞自律的な劣性のマーカーと組み合わせたX線誘発クローンを用いて行った。さらに最近では、クローンを生成するためにFLP / FRTシステムの可用性が大幅に目のセクション6,9に致死突然変異の表現型解析を容易にした。 目のセクションの分析はここで説明する接線のセクションに限定されていません。必要に応じて、ヘッドは薄膜や延髄などの頭の中でより深い層を研究するために得られる金型と横断切片内の任意の方向に整列させることができる。ここで説明するプロトコルは、このように目と頭の構造ショウジョウバエの大人の解析のための汎用的な方法です。

一般的な機器： <ul><li>一般的なフライの飼育のために10を参照してください</li><li>標準的な解剖顕微鏡（例えばニコンSMZ - 645ステレオズーム顕微鏡）、好ましくは、あなたの手の影を防ぐために、リングの光源を持つ。 </li><li>解剖時の汚れからの保護を提供するために、3MMワットマン濾紙で覆われたCO 2フライパッド、。 </li><li>ゼラチンコートしたスライド：（沸騰するのはほとんど持って、約2時間かかります）加熱板上で1Lの水で10gゼラチンと1グラムCrKSO 4 × 12 H 2 Oを溶解。ディップよく洗い（石鹸）とリンス（のdH 2 O）ゼラチン溶液と一晩箔で覆われた空気乾燥にホルダーにスライド。 </li><li>加熱オーブン（70℃、ニトロセルロースフィルターの乾燥に使用されていた古い真空オーブンは、この目的に適している）。 </li><li>たとえば電子顕微鏡施設で使用されている極薄切片（0.5-1μm厚のセクション）、することが可能ミクロトーム。我々は、ヒストグラムの品質のダイヤモンドナイフでソーバルMT5000ウルトラミクロトームを使用してください。ガラスナイフでも動作する。 </li></ul> 固定のソリューション： <ul><li> 0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2のストック溶液を調製。 </li><li> 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2（4週間に4℃で保存することができます）の2％グルタルアルデヒドを準備します。あなたが埋め込むしたい遺伝子型ごとに200μlのを持っている、少なくとも十分に行う。氷上に置きます。 </li><li>オスミウム溶液：2％の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2中OSO 4。ソリューションを保存することができないので、埋め込むしたい遺伝子型ごとに200μlのを持っている唯一の十分な確認。氷上に置きます。 </li></ul>グルタルアルデヒドとOSO 4は非常に有毒であり、十分に換気フード内で、細心の注意を払って取り扱ってください。あなたのピペットの黒化を防止するためにOSO 4を取り扱う際にはフィルター付きチップを使用してください。 脱水：30％、50％、70％、（80％）、90％、および100％エタノール溶液を作る。好ましくは、クール度30％、50％、使用前に氷上で70％エタノール。 ソリューションを染色。 1％のホウ砂のトルイジンブルーの1％です。 <table border="1"><tbody><tr><th></th><th>ソフト</th><th>ハード</th></tr><tr><td>樹脂</td><td> 54グラム</td><td> 50グラム</td></tr><tr><td>硬化剤B </td><td> 44.5グラム</td><td> 50グラム</td></tr><tr><td>アクセラレータC </td><td> 2.5グラム</td><td> 1.75グラム</td></tr><tr><td>可塑剤D </td><td> 10グラム</td><td> 0.75グラム</td></tr></tbody></table> 表1。樹脂の準備 慎重に、樹脂を調製するために、しかし十分に大きい攪拌棒とマグネチックスターラーを用いてプラスチック製ビーカーにすべての材料を混ぜる。泡を避けてください。混合後、-20℃標準シンチレーションバイアルまたは類似の容器に分注して凍結℃のあなたのEMの施設が困難製剤を要求しない限り、すべてのアプリケーションのために軟質樹脂を使用してください。 （その未重合形で発がん性）樹脂を処理するための手袋を使用してください。 70℃で一晩、機器や廃棄物に焼くの樹脂を重合する。廃棄物は、その後安全に破棄され、機器は、洗浄、再利用されることがあります。こぼれた未重合樹脂をイソプロパノールで洗浄することができます。 <table border="1"><tbody><tr><th>試薬</th><th>サプライヤー</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>パッドを飛ぶ</td><td>例えばジェネシー</td><td> 59から119 </td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>シグマ</td><td> G7526 - 10 X 10 ML </td></tr><tr><td> OSO 4 </td><td> Polysciences、（株） </td><td> 0972A - 20 </td></tr><tr><td>プロピレンオキシド</td><td>フィッシャー</td><td> 04332から1 </td></tr><tr><td> ＃3のメスハンドル、 </td><td>フィッシャー</td><td> 22080046 </td></tr><tr><td>メスの刃＃11 </td><td>フィッシャー</td><td> 08から916 - 5B </td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>フィッシャー</td><td> 13から711 - 7M </td></tr><tr><td> Durcupan（R）ACM樹脂</td><td>シグマ（フルカ） </td><td> 44610 - 1EA </td></tr><tr><td>鋼解剖針</td><td>フィッシャー</td><td> S17346 </td></tr><tr><td> BEEMフラット埋め込み型</td><td>電子顕微鏡科学。 </td><td> 70904〜12 </td></tr><tr><td>テフロン被覆かみそりの刃</td><td>電子顕微鏡科学。 </td><td> 71970 </td></tr><tr><td> Q -ティップ（滅菌綿棒） </td><td>フィッシャー</td><td> 14-959-81 </td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>フィッシャー</td><td> 12-550-143 </td></tr><tr><td>カバーは​​なし1、22X60 mmをスリップしない</td><td>フィッシャー</td><td> 12 - 531K </td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>フィッシャー</td><td> ICN96010280 </td></tr><tr><td>クロム（III）K SO 4和物</td><td>シグマ</td><td> 243361 </td></tr><tr><td>ダイヤモンドヒストグラムナイフは6mm </td><td> Diatome米国</td><td> 60彼の</td></tr><tr><td>トルイジンブルーO </td><td>フィッシャー</td><td> BP107 - 10 </td></tr><tr><td>ホウ砂（ナトリウムホウ） </td><td>フィッシャー</td><td> AC20629 - 1000 </td></tr><tr><td> DPX封入剤</td><td>シグマ</td><td> 44581 - 100ML </td></tr></tbody></table> 表2。材料

大人の準備ショウジョウバエ</emシンセクショニングおよび顕微鏡分析のための>アイズ

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

ショウジョウバエは、長い間それが遺伝的に扱いやすいですしやすさが主な要因、発展を研究するモデル系として使用されています。長年にわたり、変異株とテクニカルトリックの茄多は、洗練された質問をし、妥当な時間内に応答することができるように開発されている。既知のすべての主要なシグナル伝達経路の成分の相互作用への根本的な洞察は、順方向で得られた遺伝子ショウジョウバエの研究を逆にしている。実験室の条件下では、ハエが機能して目にすることなく生き残ることができる、ので、フライアイは、例外的に突然変異解析に適していることが証明されています。さらに、昆虫の眼の表面は、解剖顕微鏡下で見たときに定期的に、滑らかな表面を形成する約800個単位の眼（ファセットやommatidiumの複数形）で構成されています。に基づいて、画面の例については、（それぞれ、または全体的な目の大きさ、（図1。&quot;険しい目&quot;表現型）このように、それは突然変異が外部から滑らかな表面の損失を探すことによって、眼の発生や成長に影響を及ぼす可能性があるかどうかを確認するのは簡単です。外眼部の形態は、例えば1を参照してください）。眼の表現型のそれに続く詳細な分析は、大人の目の固定、プラスチック製の埋め込みと薄切片を必要とする。 ショウジョウバエの眼は、いわゆる目の成虫原基、幼虫および蛹の段階で増殖し、分化上皮細胞の袋（審査の例2を参照）から発生する。 、4つのレンズ分泌錐体細胞、色素細胞（R -細胞のクラスターの周り&quot;六角形&quot;）と毛、各個眼は8つの光受容体（図2 PRやR -細胞）を含む20セルで構成されています。 R8 [図であり、最も容易に光に敏感な器官によって識別されるそれぞれの個眼の光受容体、、rhabdomeresは、6つの&quot;外&quot;（R1 - 6）と二つの&quot;内側の&quot;光受容体（R7 / 8で構成された台形で構成されています2]）R7の下にあるため、唯一の目の深い分野からのセクションで見られる。各ファセットの台形は、正確にその隣人と目の全体の前後と背腹軸（図3A）のものに揃えて配置されます。特に、背側と腹側（それぞれ黒と赤の矢印、）のommatidiumの複数形は、目の半分は、互いに鏡像であり、平面内細胞極性シグナリング（レビューの例3を参照）中に確立された二つのキラル形態に対応しています。 半薄い目のセクションを生成する方法（例えば図3に示したものなど）がわずかにもともとトムリンソンと4レディで記述されたものから変更されてここで説明する。それは透明な錐体細胞を除くすべての細胞の形態学的分析を行うことができます。加えて、R -細胞（図中の青矢印2および3）の顔料がR -細胞の遺伝子型のための細胞自律的マーカーとして使用することができる、したがって、遺伝子の遺伝的要件R -細胞のサブセットのこと容易に5,6を決定する。

成人を準備するために標準的なアプローチ<em&gt;ショウジョウバエ</em半薄切片および光学顕微鏡分析のために&gt;目がここに表示されます。プロトコルは、眼の欠陥の総形態素解析に使用することができます、または指定された調整が目の特定の細胞タイプ（光受容体の例：クローン分析）や電子顕微鏡分析のための遺伝子の遺伝的な要件を決定するために使用することができると。

ショウジョウバエは、遺伝的な扱いやすさから、発生研究のモデル系として長年利用されてきた。長年にわたり、数多くの変異株や技術的な工夫が開発され、洗練された問いを立て、妥当な期間内で答えを得ることが可能となった。順方向および逆方向の遺伝学的研究により、既知の主要なシグナル伝達経路のすべての構成因子の相互作用に関する根本的な知見が得られている。ショウジョウバエの眼は、実験条件下において機能的な眼がなくても生存可能であるため、変異解析に極めて適していることが証明されている。さらに、昆虫の眼の表面は約800個の個別の単眼（個眼またはommatidia）で構成されており、解剖顕微鏡で観察すると規則正しく滑らかな表面を形成している。したがって、滑らかな表面の喪失（「rough eye」表現型；図1）や、眼全体のサイズの低下を外観から確認することで、変異が眼の発生や成長に影響を与えるかどうかを容易に判断できる（外眼形態に基づくスクリーニングの例については、例えば文献1を参照）。その後、眼の表現型を詳細に解析するには、成虫の眼の固定、プラスチック埋包、および薄切が必要となる。ショウジョウバエの眼は、いわゆる眼成虫原基（eye imaginal disc）から発生する。これは上皮細胞の袋であり、幼虫期および蛹期に増殖と分化を行う（レビューについては、例えば文献2を参照）。各個眼は、8個の光受容体（PRまたはR細胞；図2）、4個のレンズ分泌円錐細胞、色素細胞（R細胞クラスターを囲む「六角形」）、および1本の剛毛を含む計20個の細胞で構成される。各個眼の光受容体は、光感受性オルガネラであるラブドーム（rhabdomere）によって最も容易に識別され、6個の「外側」光受容体（R1-6）と2個の「内側」光受容体（R7/8；R8 [図2] はR7の下に位置するため、眼の深い部位の切片でのみ観察される）からなる台形に配置されている。各個眼の台形は、隣接する個眼や、眼全体の前後軸および背腹軸と正確に整列している（図3A）。特に、眼の背側半分と腹側半分（それぞれ黒色および赤色の矢印）の個眼は互いに鏡像関係にあり、平面細胞極性シグナル伝達によって確立される2つのカイラル形態に対応している（レビューについては、例えば文献3を参照）。ここで述べるセミシンセクション（図3に提示したものなど）の作製方法は、TomlinsonおよびReadyによって最初に報告された手法をわずかに修正したものである。この方法により、透明な円錐細胞を除くすべての細胞の形態学的解析が可能となる。さらに、R細胞の色素（図2および3の青色矢頭）をR細胞の遺伝子型の細胞自律的マーカーとして利用できるため、R細胞のサブセットにおける遺伝子の必要性を容易に決定できる（文献5,6）。

この手順の全体的な目的は、成体ショウジョウバエの眼を薄切し、平面細胞極性（planar cell polarity）の欠損などの変異体眼表現型の詳細な評価を可能にすることです。これは、まず麻酔したハエの頭部を切り離し、次いで眼組織を固定してエポキシ樹脂に包埋することで達成されます。樹脂が凝固した後、埋め込まれた眼をトリミングします。切片作成の最終ステップは、ダイヤモンドナイフを備えたミクロトームを用いて眼を薄切することです。最終的に、眼の切片を解析することで、新規変異体の眼の表現型の特徴付けや、PCP経路などのシグナル伝達経路における遺伝子間の遺伝学的相互作用の定量化が可能になります。どちらの手法も、新たに同定された遺伝子の生理学的役割を特性づけるのに役立ちます。この手法は、新規の変異が眼の発達にどのような影響を及ぼすか、あるいは遺伝学的相互作用解析において遺伝子がどのように相互作用するかといった、ショウジョウバエ研究における重要な疑問への回答に寄与します。眼の包埋手順におけるいくつかのステップ、例えば切片作成用モールド内での眼の配列などは、テキスト形式よりも実際の映像で見る方がはるかに理解しやすくなります。まず、ハエの頭部の固定に使用するグルタルアルデヒドおよびオスミウムの両方が毒性化学物質であるため、手袋を着用して準備を始めてください。次に、CO2を用いてハエを麻酔し、解剖顕微鏡下でワトマン紙を敷いたフライパッドの上に叩き出します。通常、1つのジェノタイプあたり6つの埋め込み頭部を確保するため、6匹に加えて予備の1匹を選別します。ピンセットでハエの胸部を軽く押し、メスを用いて頭部を取り除きます。ピンセットで頸部を触れて頭部を固定し、固定液の浸透を高めるために、片方の眼のごく一部を慎重に切り取ります。切り取った眼の表面をピンセットまたはメスで触れ、氷上のグルタルアルデヒドリン酸固定液に頭部を移します。固定工程の間は、必ず手袋を着用してください。まず、異なる遺伝子型を識別できるよう、すべての型にラベルを貼ります。次に、各型に100%樹脂を充填しますが、入れすぎないように注意してください。表面は平らになるようにしてください。転移ピペットを使用して、頭部から50%樹脂を除去します。100%樹脂に交換し、室温で3〜4時間インキュベートします。インキュベーションを通じて頭部が樹脂に馴染むにつれて、チューブの底に沈みます。爪楊枝を硬い表面に叩きつけ、先端に小さな鉤状の形を作ります。この道具を用いて、個々のモールドにハエの頭部を1つずつ移します。樹脂の飛散から保護するため、解剖顕微鏡の作業エリアにアルミホイルを敷いてください。解剖顕微鏡を用いて、解剖針で頭部をゆっくりと慎重に回します。それをモールドの底、尖った端の近くまで移動させます。頭部を下に向けた状態で、正常な目の表面をモールドの前壁に慎重に合わせます。眼の接線方向の表面が、モールド壁から概ね頭部直径の半分ほど離れていることを確認してください。解剖針を取り出す際に眼が動いた場合は、目的の位置に眼を再配置し、針を頭部から素早くわずかに後退させた後、ゆっくりと完全に抜き取ってください。すべての頭部の位置合わせが完了したら、すべての眼が動いていないか再度確認してください。樹脂から針を抜いた後、もし針が曲がっていたり位置がずれていたりする場合は、頭部の位置を調整し、型をオーブンに移して70°Cで一晩加熱してください。一晩加熱した後、型を曲げて硬化したブロックを取り出します。どのブロックがどの遺伝子型に対応するかを把握するため、ラベルを貼った容器に入れて保管してください。ブロックをトリミングするために、解剖顕微鏡下で目が上を向くようにブロックをミクロトームのチャックに固定します。テフロンコーティングされたカミソリ刃を用いて、ブロックの最上層のみを注意深く切り落とします。これにより、目を確認できる透明な表面ができ、切片作成の切断面を決定することができます。次に、頭部の両側および前面の余分なプラスチックを、頭部の周囲のプラスチックがほとんど取り除かれるまでカットします。清潔なカミソリを使用し、薄いプラスチックの層を何度も少しずつカットしながら、ゆっくりと頭部に近づいていくのが最善です。切断したい正確な平面になるまで、目の上部から薄い層を慎重に取り除いてください。各カットごとにカミソリの刃の新しい箇所を使用し、眼の外表面に達するまで切り進めてください。トリミング後のブロックは、切断平面に相当する上面がわずかに傾斜した三角錐状になります。ブロックをミクロトームにセットし、薄切を開始してください。20～30枚の切片が作成されるまで、得られた切片はリザーバー内の水面に浮いた状態になります。100 °Cに設定したホットプレートの上にスライドガラスを置きます。次に、綿棒の平らな端を用いて、回転させるように水面下から最初の切片の一群をすくい上げ、水滴の中へと転送します。スライド上で、水が蒸発し、切片がスライドに付着するまで待ち、その後、別の20〜30枚の切片で同様の操作を繰り返します。通常、6滴の水滴上に配置した3つの目の切片が、1枚のスライドに適切に収まります。すべての切片をスライド上に回収したら、染色を行い、顕微鏡観察のために封入します。野生型ショウジョウバエの目の接線切片。TIAは正常な極性を示し、以下の模式図に黄色い線で示されている背腹対称線に対して適切に配向しています。野生型目の適切に配向したtiaとは対照的に、ここに示すstrabismus変異体の目ではtiaの極性が失われており、光受容体の全セットが存在しているものの、回転と極性はランダムになっています。また、色素細胞格子の色素および個々の光受容細胞が消失していることにも留意してください。strabismus変異体はwhite minusの遺伝的背景にあったため、drosophila ro kinase（drop）はホモ接合致死の変異であり、クローン解析を必要とします。ここでは、ホモ接合変異クローンは色素の欠損によって標識され、回転欠損や、単一細胞レベルでの光受容細胞の欠損または過剰数を含む構造的欠損を示します。変異体および野生型の光受容細胞の例を、それぞれ白抜きまたは塗りつぶしの青色の矢印頭で示しています。このビデオを視聴することで、ショウジョウバエの眼の包埋および切片作成方法について十分に理解できるはずです。約3日間の習得期間を経て、眼の表現型を詳細に分析することが日常的に可能になり、眼の発達における新規遺伝子の機能を検討できるようになります。

preparation-adult-drosophila-eyes-for-thin-sectioning-microscopic

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、固定、包埋、切片、および後期のイメージングのためのプロセスについて説明...

の電子顕微鏡のための胚の調製ショウジョウバエ胎児心臓の管

このプロトコルは、次の3つについて説明します...

開発と大人の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>脳と網膜

ショウジョウバエシュナイダー（S2）細胞は、遺伝子の発見と機能解析のためのますます普及システムです。私たちの目標は、このような重要性を増し、実験システムS2細胞を作る顕微鏡技術のいくつかを説明することです。...

の準備ショウジョウバエ</em光学顕微鏡用> S2細胞

幼虫、蛹および成人の解剖と免疫組織化学<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;網膜

このビデオでは、成虫のハエの無傷の脳をブリッジスライドの下に埋込む方法を説明し、蛍光顕微鏡法のために免疫染色された脳に対して行われるプロトコールを示しています。...

成虫ショウジョウバエの脳のマウント:共焦点イメージング用のスライドを準備する方法

このビデオでは、ショウジョウバエの頭部をパラフィンに埋め込む方法、つまりフライヘッドをシリアルセクショニング用に準備する技術であるカラー法を使用して説明しています。パラフィン切片は、脳の解剖学的構造の組織学的検査や神経変性の評価に使用されます。この注目のプロトコルは、1つの調製物で複数のハエを処理できるため、時間効率が向上し、実験アーティファクトが最小限に抑えられることを示しています。...

成虫ショウジョウバエの頭部のパラフィンへの埋め込み:組織学のための組織の準備

大人ショウジョウバエの脳は神経回路、高次脳機能、および複雑な疾患を研究するための貴重なシステムです。小さなハエの頭から全脳組織を分析するための効率的な方法は、脳ベースの研究を促進します。ここでは、よく保存された形態を有する成人の脳の簡単な、ワンステップ解剖プロトコルを記述します。...

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ブレインズ

SEM 解析、種の同定や表現型差別を支援する効果的な方法です。このプロトコルは 3...

原核生物と真核生物の化学形態分析走査電子顕微鏡 (SEM) での乾燥の準備

免疫組織化学、西部の分析、および RNA 抽出のための組織の処理のためのプロトコル、ショウジョウバエ蛹網膜を解剖するための手術方法を提案する.

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

このプロトコルは、イメージングのために幼虫および成虫の ショウジョウバエ...

視葉可視化のためのショ ウジョウバエ の幼虫および成虫の脳の解剖、免疫組織化学、およびマウント

ここでは、成虫の ショウジョウバエ...

成人の ショウジョウバエ の外部構造を定量するための迅速でシンプルなワークフロー

学ぶ大人のショウジョウバエ眼の半薄切片作成と顕微鏡解析法。エポキシ樹脂包埋とダイヤモンドナイフを用いたミクロトーム切片により、変異体の眼表型や遺伝的相互作用を詳細に評価できます。

大人の準備ショウジョウバエアイズ

さらに動画を探す