中皮細胞の単離:ヒト大網組織標本から初代中皮細胞を単離する技術

ヒト初代間皮細胞 (HPMC) は、大網や腹腔内に存在する脂肪組織の層などの多くの内臓器官の内側を覆っています。

中皮細胞を単離するには、まずヒト大網検体を適切な緩衝液に浸して過剰な赤血球または赤血球を除去します。次に、大網をガラス皿に入れ、細かく刻みます。これにより組織が解離し、汚染された赤血球とともにHPMCが放出されます。

ピースを円錐形のチューブに移し、希望の時間静止させます。低密度脂肪が豊富なみじん切り組織は上部に上昇し、密な細胞成分は下部に沈殿します。次に、HPMCとRBCを含む底部の液体を新しいチューブに吸引します。

遠

心分離して細胞を収集します。緩衝液を含む上清を取り除きます。ペレットを中皮増殖培地に再懸濁し、所望の時間インキュベートします。培地は、赤血球に対するHPMCの選択的増殖を促進します。

光学顕微鏡で細胞を観察し、直方体状のヒト中皮細胞の増殖を確認します。

外科用ヒト大網標本を取得したら、すぐにサンプルを室温PBSに浸します。浸漬後2時間以内に、大網を20ミリリットルの新鮮なPBSを含む50ミリリットルの円錐形のチューブに移します。初代ヒト中皮細胞またはHPMCおよび赤血球を含む残りのPBS洗浄液を新しい50ミリリットルの円錐形チューブに移し、細胞をスピンダウンします。

次に、チューブの内容物を10センチメートルの滅菌培養皿に注ぎ、2本のメスを使用して組織を5立方ミリメートルにみじん切りにします。初代ヒト中皮細胞またはHPMCを単離するには、大網片を50ミリリットルの円錐形のチューブに移し、固形片が上部に浮くまで1分間待ちます。HPMC は、赤血球とともにチューブの底に沈殿します。

ピペットを使用して、中皮細胞と赤血球を含むPBS洗浄液をペレット細胞を含むチューブに移し、細胞をスピンダウンします。次に、20ミリリットルの新鮮なPBSを大網に加え、元のペレット細胞に示したように、PBS含有HPMCとRBCをさらに3回収集します。

最後のスピン後、細胞を75平方センチメートルのフラスコに15ミリリットルの完全増殖培地にプレートします。大網サンプルから追加のHPMCを単離するには、残りの固形組織を200ミリリットルのPBSで200 RPMおよび摂氏37度で振とうします。10分後、サンプルを1分間休ませて、固形組織がチューブの上部まで上昇します。

次に、先ほど示したように、チューブの底からHPMCとRBCを収集します。次に、二次洗浄から細胞をスピンダウンし、15ミリリットルの完全増殖培地で別の75平方センチメートルのフラスコにプレートします。残りのHPMCを単離するには、PBSと10ミリリットルのトリプシン-EDTAの混合物で組織をさらに10分間振とうし、これらのHPMCとRBCを75平方センチメートルのフラスコにプレートします。

次に、加湿環境で培養物を摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。使用済み培地を除去せずに、3日目と5日目に15ミリリットルの新鮮な完全増殖培地をプレーティング細胞に供給します。HPMC は、直方体の形状とサイトケラチン-8 とビメンチンの発現によって識別できます。