ホールマウント免疫蛍光イメージング:インタクトオルガノイドを評価するための固定および染色技術

前立腺オルガノイドは、主に基底上皮細胞の外層と、中央内腔の周囲に配置された管腔上皮細胞の内層を構成します。

ホールマウントイメージングにより、無傷の3Dオルガノイドの形態と不均一性を維持しながら研究することができます。染色を開始するには、オルガノイドを適切な固定剤で処理して細胞成分を所定の位置に固定し、それによって保存します。サンプルを洗浄して余分な固定液を除去します。

ブロッキング溶液とDNA染色色素のカクテルでインキュベートします。ブロッキング溶液中のタンパク質は、細胞の非特異的部位に受動的に結合し、バックグラウンド染色を減らします。同時に、DNA染色色素は細胞の核を染色します。

2つの構成細胞集団によって発現される特定の抗原を標的とする2セットの一次抗体を追加します。一次抗体に結合する2つの異なる蛍光色素結合二次抗体でインキュベートします。サンプルを洗浄して、結合していない抗体を除去します。

染色したオルガノイドを界面活性剤含有糖溶液の濃度を上げて順次浸漬し、オルガノイド構造を損なうことなく組織の透明性を改善します。この処理により、サンプルのイメージング深度が向上します。

オルガノイドをスペーサーを装着した顕微鏡スライドに取り付けて、イメージング中に3D形態を維持します。共焦点顕微鏡を使用して、中心内腔の周囲に配置された基底細胞集団と管腔細胞集団からの蛍光放出を観察します。

前立腺オルガノイドの全マウント免疫蛍光染色を行うには、まず、500マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドをPBSに添加します。オルガノイドを室温で2時間インキュベートし、穏やかに振とうします。テキストプロトコルに記載されているようにペレットを洗浄した後、ブロッキング溶液に1ミリリットルあたり1マイクログラムのDAPI染色を加え、室温で2時間インキュベートします。このステップから、インキュベーション中はサンプルを光から保護します。オルガノイドを先ほど遠心分離した後、一次抗体とブロッキング溶液を加え、穏やかに振とうしながら摂氏4度で一晩インキュベートします。

オルガノイドを再度ペレット化し、ペレットを1ミリリットルのPBSで15分間穏やかに振とうしながら洗浄します。この洗浄手順を2回繰り返します。次に、二次抗体とブロッキング溶液を加え、穏やかに振とうしながら摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、オルガノイドをペレット化し、ペレットをさらに2回洗浄します。ペレット状オルガノイドに1ミリリットルの30%スクロースを1%Triton X-100を含むPBS中に加えます。その後、室温で2時間、軽く振とうしながらインキュベートします。

オルガノイドを再びペレット化した後、1ミリリットルの45%スクロースを1%Triton X-100を含むPBSに加え、室温で2時間穏やかに振とうします。次に、1ミリリットルの60%スクロースを1%Triton X-100を含むPBSに加える以外は、手順を繰り返します。室温で800 x g で3分間遠心分離することによりオルガノイドをペレット化し、上清の95%を除去します。ペレットを紫外線下で観察し、上清の除去中にペレットが失われていないことを確認します。スクロースの濃度が高くなると、ペレットは緩くなります。残りの懸濁液の10〜20マイクロリットルをチャンバー付きカバーガラスに移し、共焦点顕微鏡検査に進みます。