好中球細胞外トラップまたはNETの蛍光顕微鏡法:がん細胞とNETとの間の接着相互作用を観察する技術

がんなどの病理学的条件下では、活性化された好中球は好中球細胞外トラップまたはNET(細胞外DNAと関連する酵素および抗菌タンパク質のメッシュ)を放出し、循環がん細胞を閉じ込めます。

NETと腫瘍細胞との接着相互作用をin vitroで可視化するには、まず、好中球サブタイプである低密度好中球を、細胞付着を促進するポリマーコーティングされた培養皿で培養します。数時間インキュベートして好中球を刺激してウェブ状NETを形成します。

赤色フルオレセイン標識がん細胞の懸濁液を好中球培養物に加えます。がん細胞とNETの相互作用を促進するために、がん細胞をNETと短期間インキュベートします。NET-DNA は、がん細胞を引き付け、NET への接着を促進する走化性因子として作用します。

使用済み培地を取り除きます。培養物を適切な新鮮な培地で穏やかに洗浄し、培養ウェルから付着していない腫瘍細胞を除去します。

次に、膜不透過性の緑色蛍光核染色剤を追加して、細胞外NETを選択的に着色します。蛍光顕微鏡で培養物を観察します。好中球の細胞外トラップは、赤い腫瘍細胞が付着するメッシュを形成する緑色の糸状構造として現れます。

単

離された低密度好中球を、FBS濃度を添加したRPMI 1640培地の1ミリリットルあたり5倍10〜6番目の細胞に再懸濁し、6ウェルのポリ-L-リジンコーティングプレートにウェルあたり1ミリリットルの好中球を播種します。摂氏37度、二酸化炭素5%で2時間後、製造元の指示に従って、適切な蛍光膜不透過性核色素および染色体色素で各ウェルの細胞を染色し、直ちに蛍光顕微鏡でNETの形態を観察します。

NETへの腫瘍細胞の接着を評価するには、対照蛍光色素で染色した胃腫瘍細胞を、0.1%のウシ血清アルブミン濃度を添加したRPMI 1640の1×10〜6ミリリットルで再懸濁し、低密度好中球培養の各ウェルに1ミリリットルの腫瘍細胞を追加します。摂氏37度で5分後、各ウェルから上清を取り出し、洗浄ごとにBSAを添加した2ミリリットルの予熱RPMI 1640培地で細胞を2回穏やかに洗浄します。

5分間のインキュベーションは、NET特異的結合を検出するのに十分な時間です。温かい培地を各ウェルの側面にゆっくりと加え、プレートをそっと回転させ、吸引器で上清を取り除きます。

NETと付着した腫瘍細胞は、蛍光顕微鏡で観察できます。