エキソソームブロック調製:培養ヒト結腸癌細胞からのエクソソームを保存するためのプロトコール

エクソソームは、培養細胞から上清に分泌される細胞外小胞構造です。エクソソームブロックを調製するには、まずエクソソームを含む培養上清をチューブに取ります。チューブを高速で遠心分離して、無傷のエキソソームをペレット化します。残りの上清を捨てます。

固定バッファー中に存在するグルタルアルデヒドでエクソソームペレットを処理します。エクソソームの形態を維持するために、混合物を氷上で所望の時間インキュベートします。グルタルアルデヒドはエクソソームに浸透し、タンパク質を架橋します。固定バッファーは、下流の固定プロセスのためにエクソソームを中性pHに維持します。

グルタルアルデヒド含有緩衝液を廃棄し、膜二重層を透過性化し、エクソソームに存在する脂質を固定する二次固定剤である四酸化オスミウム溶液を加えます。四酸化オスミウム溶液を除去し、エクソソームを一連の濃度のアセトンで処理します。このプロセスにより、エクソソームが脱水されます。

無水アセトンを包埋培地アセトン混合物に置き換えます。徐々に、この混合物への包埋培地の比率を増

やします。

エクソソームを含む包埋混合物を目的の型に注ぎます。型を高温でオーブン乾燥させます。これにより、エクソソームの周囲に包埋媒体が重合し、ブロックが発生します。

精製したエキソソームペレットを固定するには、pH 7.0の0.1 Mカコジル酸ナトリウム溶液に1ミリリットルの2.5%グルタルアルデヒドを加えます。脂質二重層小胞を摂氏4度で1時間インキュベートします。次に、固定液を取り除き、ペレットを1ミリリットルの0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で室温で10分間すすぎます。

次に、サンプルを1ミリリットルの2%四酸化オスミウムで摂氏4度で1時間ポスト固定します。固定液を取り出し、エクソソームペレットを0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回すすぎ、10分ごとに緩衝液を交換します。次に、一連の段階的なアセトン濃度でそれぞれ10分間振とうて、サンプルを脱水します。

次に、アセトン3部と低粘度包埋混合物1部の溶液を混ぜます。アセトンをこの混合物に置き換え、サンプルを30分間インキュベートします。低粘度包埋培地の比率を増やし続け、各ステップで30分間インキュベートします。

最後に、エクソソームペレットを低粘度包埋混合物の100%で室温で一晩インキュベートします。翌日、包埋金型を使用してサンプルを純粋な低粘度包埋混合物に包埋し、摂氏65度で24時間焼きます。