JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 3:36 分 • April 30th, 2023
エクソソームは、がんのバイオマーカーとして機能するさまざまな生体分子を囲む小さな細胞外小胞です。
エクソソームバイオマーカーを視覚化するには、適切な電子顕微鏡金属グリッドで支持された極薄の樹脂包埋エキソソーム切片から始めます。グリシン滴でグリッドをインキュベートします。グリシンは、切片内の反応性アルデヒド基に結合して中和し、アッセイへの干渉を克服します。
サンプルを水ですすぎ、残留試薬を除去します。続いて、サンプルをブロッキングバッファーでインキュベートします。バッファーは、サンプル中の非特異的抗体結合部位をブロックする血清タンパク質を運びます。
次に、サンプルを目的の一次抗体溶液でインキュベートします。これらの抗体は、エクソソーム内腔に局在する標的バイオマーカーを認識し、結合します。結合していない抗体を適切なバッファーで洗い流します。
次に、サンプルを含むグリッドを、一次抗体に結合する金結合二次抗体を含む液滴に移します。金ナノ粒子は、標的分子の微細な局在化を視覚化するための電子密度の高いマーカーとして機能します。結合していない二次抗体を適切なバッファーで洗い流します。
最後に、暗い条件下で、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛溶液中でグリッドを順次インキュベートします。これらの重金属試薬は、サンプル中の脂質、タンパク質、グリコーゲンなどの有機分子を染色してコントラストを高め、バックグラウンドから区別します。
透過型電子顕微鏡で染色部分を観察します。金標識バイオマーカーは、重金属で染色されたエキソソーム構造の内腔内に暗い粒子として現れます。
まず、厚さ60ナノメートルの未染色切片を含むグリッドを50マイクロリットルの0.02Mグリシン滴で10分間インキュベートし、遊離アルデヒド基を消光します。次に、切片を100マイクロリットルの蒸留水で3回、それぞれ10分間すすぎます。最後のすすぎに続いて、1%BSAを含むPBS中で室温で切片を1時間インキュベートします。次に、50〜100マイクロリットルの抗KRS抗体滴でグリッドを1時間インキュベートします。
次に、0.1%BSAを含むPBSを一滴でグリッドを10分間5回洗浄します。次に、グリッドを適切な二次抗体の滴に移し、切片を室温で1時間インキュベートします。次に、0.1%BSAを含むPBSを別々に滴下して、グリッドを10分間5回洗浄します。切片を2%酢酸ウラニルで暗所で20分間二重染色し、続いてレイノルドクエン酸鉛を10分間染色します。染色切片を透過型電子顕微鏡に入れ、80 kVを使用してサンプルを観察し、顕微鏡ソフトウェアを使用して画像化します。