精製エクソソームのネガティブ染色:透過型電子顕微鏡によるエクソソーム形態の可視化法

エクソソーム(ナノサイズの球形小胞)の陰性染色を行うには、まず適切な電子顕微鏡グリッドを採取します。グローディスチャージャーを使用してグリッドを準備します。このプロセスにより、グリッド表面が親水性になり、サンプルの接着性が向上します。

同時に、精製されたエキソソームの懸濁液をチューブに取ります。チューブにパラホルムアルデヒド(サンプル固定剤)を補充し、インキュベートします。パラホルムアルデヒドはエクソソームに浸透し、タンパク質と核酸を架橋します。このステップは、エクソソームの形態を維持するために不可欠です。

次に、エクソソーム懸濁液を事前に準備されたグリッドにロードし、吸着が起こるようにインキュベートします。次に、重金属の染みである酢酸ウラニルをグリッドの上に数滴加えます。ウラニルイオンは膜タンパク質と脂質に結合し、エキソソーム境界の周りに沈着物を形成します。

最後に、グリッドを水で洗って余分な汚れを取り除きます。グリッドを乾燥させ、透過型電子顕微鏡またはTEMを使用して画像化します。

電子ビームがエクソソームに当たると、試料を取り巻く染色がより多くの電子を散乱させます。エクソソームは電子密度が低いため、ビームを通過させることができます。これらの異なる散乱電子は、イメージングシステムによって捕捉され、高コントラスト画像が形成されます。

陰性染色されたエクソソームは、周囲に暗い境界があり、明るく見えます。

陰性染色を行うには、単離後の精製エクソソームを1ミリリットルの2%パラホルムアルデヒドで5分間固定します。薄いフォームバー/カーボンフィルムコーティングされた200メッシュ銅EMグリッドをグロー放電で1分間処理します。次に、5〜7マイクロリットルのエクソソーム懸濁液をグリッド上にロードし、1分間インキュベートします。エクソソームの濃度が高すぎる場合は、濃度を適切なレベルに希釈してください。

すぐに、EMグリッドの表面にろ過した1%酢酸ウラニル溶液を約20滴垂らしてエクソソームを染色します。グリッドの端をろ紙で接触させて、余分な酢酸ウラニル溶液をグリッドから取り除きます。次に、グリッドを一滴の水ですばやくすすぎます。

ピンセットを使用してグリッドをテーブルの上に置き、グリッドを培養皿で部分的に覆います。グリッドを室温で10分間乾燥させてから、グリッドを画像化するか、将来の観察のために電子顕微鏡グリッドボックスに保管します。