RNA In Situハイブリダイゼーションにおけるプローブハイブリダイゼーションとシグナル増幅:組織切片中の特定のRNA配列を検出するための技術

細胞内の特定のRNA配列を検出するには、まずスライドガラスで組織切片を採取します。組織切片を、標的RNAプローブを含む適切なハイブリダイゼーションバッファーでオーバーレイします。

これらのプローブは、一方の端に標的認識部分、もう一方の端に尾部配列を持つZ字型のRNA分子です。スペーサーアームは、これら2つの端をリンクします。

次に、スライドをハイブリダイゼーションオーブンで最適な温度でインキュベートします。Z字型RNAプローブは細胞に入り、対応する標的mRNA配列とペアでハイブリダイズします。

スライドをオーブンから取り出します。スライドを洗浄液に浸漬し、結合していないプローブと余分なハイブリダイゼーションバッファーを除去します。

その後、プリアンプ溶液を加えてインキュベートします。プリアンプ分子は、隣接する2つのZプローブのテールシーケンスに結合します。この分子は単一の Z プローブに結合しないため、特異性が保証されます。

次に、増幅器試薬混合物を加えてインキュベートします。複数の増幅器分子が単一のプリ増幅器配列にハイブリダイズします。

最後に、組織切片を目的の標識プローブで標識し、細胞内の特定のRNA配列の存在を検出します。

ハイブリダイゼーションを開始するには、スライドをタップしてフリックして余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。予熱したHPVプローブをオーブンから取り出し、約4滴を加えて各セクションを完全に覆います。トレイに蓋をして、摂氏40度のオーブンに2時間入れます。インキュベーションが完了したら、トレイをオーブンから取り外し、スライドラックを取り外します。

一度に1枚ずつ、余分な液体をすばやく取り除き、スライドを1x洗浄バッファーで満たされた染色皿に浸したスライドラックに入れ、スライドを室温で2分間洗浄し、一定の攪拌で、新鮮な1x洗浄バッファーで繰り返します。タップしてフリックしてスライドから余分な液体を取り除き、スライドラックに再度置きます。各セクションを完全に覆うために、セクションごとに約4滴の室温AMP1を追加します。トレイに蓋をして、摂氏40度のオーブンに30分間入れます。

オーブンからトレイを取り出した後、スライドラックを取り外します。一度に1枚のスライドを作業し、余分な液体をすばやく取り除き、スライドを1x洗浄バッファーで満たされた染色皿に沈めたスライドラックに入れ、室温で2分間洗浄し、一定の攪拌で洗浄し、新鮮な1x洗浄バッファーで繰り返します。