人工多能性幹細胞からのヒト腎臓足細胞の誘導:幹細胞からの成熟腎臓足細胞の指向性分化のための手順

成熟細胞は、幹細胞のような未分化増殖状態を取り戻すために再プログラムすることができます。これらの再プログラムされた細胞は、人工多能性幹細胞またはIPSCと呼ばれます。多能性細胞を腎臓からの老廃物のろ過に関与する足細胞特化細胞に分化させるには、まずヒトIPSCの懸濁液を中胚葉誘導培地に摂取します。

この懸濁液を基底マトリックスでコーティングされた培養プレートに移し、インキュベートします。基底マトリックスは、基部でのIPSCの接着を促進します。その後、培地中に存在する特定の因子は、IPSCの足細胞の前駆細胞である中胚葉細胞への分化を誘導します。使用済み培地を吸引します。

プレートに所望の容量の中間中胚葉誘導培地を補充し、長時間インキュベートします。このステップにより、中胚葉細胞が未熟な足細胞に分化します。中間中胚葉誘導培地をトリプシン溶液に交換して、接着細胞をプレートから解離させます。

次に、遠心分離して細胞をペレット化します。トリプシン溶液とマトリックス断片を含む上清を廃棄します。ペレットを足細胞誘導培地に再懸濁します。細胞懸濁液を新鮮なコーティングされた培養プレートに移します。インキュベートして、中間細胞からいくつかの足のような突起を発達させ、成熟した足細胞を形成します。

計数後、細胞を中胚葉誘導培地濃度の1〜10〜5番目の細胞濃度に再懸濁し、基底膜マトリックス2コーティングプレートから細胞外マトリックス溶液を吸引します。プレートを温かい培地で2回すすぎ、ヒト人工多能性幹細胞懸濁液を穏やかなピペッティングで混合します。

基底膜マトリックス2コーティング12ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの細胞を加え、プレートを軽く振って細胞をより均一に分布させます。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。分化の2〜15日目に、中胚葉誘導培地をウェルあたり1ミリリットルの中間中胚葉誘導培地に交換します。

培地の黄変によって示されるように、実質的な細胞増殖および栄養素の急速な枯渇が観察される場合、中間中胚葉分化培地の容量はウェルあたり1.3ミリリットルに増加することができる。培養16日目に、中間中胚葉細胞を温培地ですすぎ、ウェルあたり500マイクロリットルの0.05%トリプシン-EDTAで細胞を摂氏37度で3分間インキュベートします。

細胞が解離し始めたら、細胞リフターで細胞をこすり、ピペッティングで細胞を穏やかに混合します。ウェルあたり約2ミリリットルのトリプシン中和液で反応を停止し、細胞を50ミリリットルのコニカルチューブに移します。培地で容量を最大50ミリリットルにし、遠心分離によって細胞を収集します。

ペレットおよび足細胞誘導培地を培地濃度1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の1倍に再懸濁し、細胞を基底膜マトリックス2コーティングプレートに加えます。次に、プレートを軽く振って細胞をより均一に分散させ、細胞をインキュベーターに最大5日間入れます。