ルシフェラーゼタグ付き神経膠腫幹細胞モデル:ルシフェラーゼタグ付き神経膠腫幹細胞をIn Vitro治療研究用に調製するためのレンチウイルス媒介法

神経膠腫幹細胞またはGSCは、神経膠腫の亜集団であり、脳内のグリア細胞の癌です。

これらのGSCにルシフェラーゼなどの生物発光酵素をタグ付けすることで、薬物スクリーニングのためのハイスループットイメージングアッセイを確立するのに役立ちます。

ルシフェラーゼタグ付きGSCを調製するには、適切な増殖培地でGSCを培養することから始めます。

培養物を遠心分離して細胞ペレットを取得し、上清を除去します。

ペ

レットに適切な消化酵素を加えます。これらの酵素は細胞クラスターを解離し、結合組織の痕跡を分解して単一細胞懸濁液を得る。

次に、単一細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去します。ペレットを新鮮な培地に再懸濁します。

次に、培養プレートに所望の濃度の細胞を播種します。

培養物をインキュベートし、細胞を培養プレートに付着させます。

続

いて、ルシフェラーゼ増強緑色蛍光タンパク質またはEGFP用のウイルス含有遺伝子コンストラクトの所望の力価を加えてインキュベートします。

ウイルスはGSCの表面受容体と相互作用し、ルシフェラーゼ-EGFPを含むウイルスRNAの放出を引き起こします。細胞酵素は、RNAの二本鎖DNAへの逆転写を触媒し、GSCのゲノムに組み込んでいます。

蛍光顕微鏡で可視化すると、ルシフェラーゼ発現細胞はEGFPから発せられる蛍光により緑色に見えます。

まず、

培地から神経膠腫幹細胞またはGSCを収集し、室温で70 x gで3分間遠心分離します。上清を除去した後、細胞をアキュターゼで摂氏37度で4分間

消化します。

200マイクロリットルのチップを使用して、細胞を繰り返しピペットで移動し、細胞ペレットを解離および再懸濁します。1ミリリットルの培地に200,000細胞の密度でGSCを12ウェル培養プレートの各ウェルに加え、一晩インキュベートします。

翌日、30マイクロリットルのルシフェラーゼ-EGFPウイルス上清をプレートの各ウェルに加えます。細胞を摂氏25度で2時間、1,000×gで遠心分離し、一晩インキュベートします。

翌日、GSCを収集し、遠心分離し、上清を除去し、新鮮な培地に再懸濁し、再プレーティングすることにより、ウェル内の培地を交換します。細胞をさらに48時間培養します。

プレートを蛍光顕微鏡で観察し、GFP陽性細胞の出現を確認します。