ゼブラフィッシュ幼生からの脳細胞単離:ゼブラフィッシュ脳組織から無傷のニューロン、マクロファージ、およびミクログリアを得る技術

ゼブラフィッシュの脳は、ニューロン、つまり情報処理に重要な役割を果たす神経細胞で構成されています。さらに、ニューロン間空間に生息するマクロファージやミクログリアなどの支持免疫細胞の集団で構成されています。

これらすべてのタイプの脳細胞をゼブラフィッシュから分離するには、まず、麻酔をかけたゼブラフィッシュの幼虫を適切な培地を含むペトリ皿に入れます。

ゼブラフィッシュを実体顕微鏡で視覚化し、卵黄嚢の上の幼虫の頭を横断して脳を無傷に保ちます。

切除したヘッドを、氷の上に置いた予備冷却培地で満たされたホモジナイザーに移します。低温は脳細胞の劣化を防ぐのに役立ちます。

乳棒で、ゼブラフィッシュの脳組織を均質化します。均質化は細胞外マトリックスを崩壊し、脳組織からのニューロン、マクロファージ、およびミクログリアの解離を開始します。

このステップでは、脂質が豊富な絶縁層であるミエリンもニューロンから分離されます。

ホモジネートをストレーナーに通し、大きな細胞の塊を捕捉します。

濾液を遠心分離して、細胞とミエリン鞘断片をペレット化します。破片を含む上清を廃棄します。

ペレットを適切な密度勾配培地に再懸濁し、バッファーで重ねます。

チューブを低速で回転させます。軽いミエリン断片は、バッファーと密度勾配培地の界面に明確なバンドを形成し、密度の高い細胞は底部に沈殿します。

最上層を吸引し、脳細胞を新鮮な培地に再懸濁してさらに使用します。

リットルの幼虫50ミリリットルあたり1.5ミリリットルの15ミリモルトリカインを加えて、麻酔を準備します。次に、3ミリリットルのパスツールピペットを使用して、一度に10匹の幼虫をトリカインを含む氷冷のE3培地で満たされた55ミリメートルのペトリ皿に移し、最終麻酔

実体顕微鏡下で、ペトリ皿の中央に10匹の幼虫を整列させます。次に、外科用はさみを使用して、卵黄嚢の上の幼虫の頭を横断します。

3ミリリットルのパスツールピペットを使用して、すべてのヘッドを取り、できるだけ少ない液体で、1ミリリットルの氷のように冷えたメディアAを含む氷上のガラスホモジナイザーに移します。

氷冷したE3とトリカインを含む各小さなペトリ皿を30分ごとに新しいものと交換して、冷たいE3とトリカイン培地で切断が実行されるようにします。

色が薄くなり始めたら、ガラスホモジナイザーの氷のように冷えたメディアAを交換します。ヘッドのグループ全体が収集されたら、ガラスホモジナイザーからすべての培地Aを取り出し、1ミリリットルの新鮮な氷冷培地Aと交換します。

ホモジナイザーを氷上に置いたまま、ぴったりとフィットする乳棒を使用して、3〜5 dpfの幼虫に対して40ラウンドの粉砕と回転、7および8 dpfの幼虫に対して50ラウンドを実行して脳組織を破壊します。

次に、2ミリリットルの培地Aを細胞懸濁液に加えて細胞を希釈し、ミエリンとの凝集を減らします。細胞懸濁液を40ミクロンの細胞ストレーナーを通して氷上の冷たい50ミリリットルのファルコンチューブに通すことにより、細胞凝集を排除します。この手順を 3 回繰り返します。

1ミリリットルの細胞懸濁液のアリコートを冷たい1.5ミリメートルのチューブに移し、300 x gおよび摂氏4度で10分間回転させます。次に、23G x 1インチの針が付いた10ミリリットルの注射器を使用して、上清を取り除きます。

1ミリリットルの氷冷22%密度勾配培地を0.5ミリリットルの氷冷1x DPBSでやさしく重ねて、細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。チューブを950 x gで休憩なく回転させ、摂氏4度で30分間ゆっくりと加速します。

スピン後、界面に閉じ込められたDPBS密度勾配培地とミエリンを廃棄します。次に、2%NGSを含む0.5ミリメートルの培地Aを使用して細胞を洗浄し、チューブを摂氏4度で300 x g で10分間回転させます。

多くの上清を除去し、同じ実験条件から細胞ペレットを2%NGSを含む1ミリリットルの培地Aにまとめて引き出します。

目的の細胞が蛍光タンパク質を発現する場合は、細胞懸濁液を35ミクロンの細胞ストレーナーキャップに通し、光から保護された氷上の冷たい5ミリリットルのFACSチューブに移します。