マウス胚性尿路におけるメチレンブルー色素注射:尿路における先天性閉塞を評価する方法

尿路閉塞を評価するには、周産期のマウス胚を仰臥位に固定することから始めます。次に、胚の腹腔を解剖して、一対の腎臓、尿管、および尿道のある総膀胱からなる完全に発達した尿路を見つけます。

次に、マイクロニードルが取り付けられたチューブに接続された空の注射器を取ります。アセンブリにメチレンブルー溶液(濃い青色の追跡染料)を充填します。マイクロニードルを腎盂の内腔(腎臓の尿管の漏斗状の拡張した近位端)に挿入し、染料溶液を注入します。

静水圧により、染料は腎臓の腎盂から尿管を通って流れ、最終的に膀胱の内腔に蓄積します。反対側の腎臓で染料注入手順を繰り返して、尿路の対応する側からの染料の流れを確認します。

最後に、カメラ付きの実体顕微鏡を使用して尿路を画像化します。画像検査では、閉塞のない尿路は膀胱に深く染色されていますが、閉塞のある異常な尿路は染料の自由な流れを制限します。閉塞の程度に応じて、膀胱内腔に色素が完全または部分的に欠如していることが観察されます。

鉗子を使用して、皮膚を慎重に引き裂き、胚の腹腔を開きます。次に、肝臓、胃、腸などの余分な臓器や組織を鉗子で慎重に取り除き、鉗子を切断または引き抜き、背側にある腎臓、尿管、膀胱を露出させます。滅菌ガーゼパッドで解剖された胚から余分な血液を吸収し、染色注入を続けます。

静

水圧によって針先からメチレンブルー溶液を排出することにより、針とチューブ内の気泡を除去します。染料溶液の入ったシリンジを針先の高さより上に持ち上げて流れを開始し、シリンジを下げて流れを止めます。次に、近位尿管近くの腎盂に針を挿入し、一度配置すると針を邪魔しないように注意します。腎臓に色素注入を行い、尿路閉塞を判断します。

腎盂に針を適切に挿入することで、この検査の成功が決まります。腎臓にも血管にも向かって、尿管に向かって腎盂に針を挿入する必要があります。

シリンジを約20センチ持ち上げて静水圧を与え、15〜16マイクロリットルの染料溶液を流します。次に、最初に腎盂から始まり、次に尿管の長さ、そして最後に膀胱内腔で染料の青色を監視します。注射器を下に置いて染料の流れを止め、腎臓から針を抜きます。腎臓の水腎症、水尿管、および染料溶液の最終位置を実験ノートに記録します。

最後に、対側腎臓の注射を行い、染料を合計20秒間流します。実体顕微鏡に接続されたカメラとイメージングプログラムを使用して、色素溶液でトレースされた腎臓、尿管、膀胱の画像を撮影します。