順行性灌流モデル:単離されたマウス心臓を灌流するためのEx Vivo技術

麻酔をかけたマウスを仰臥位にすることから始めます。胸腔を解剖して心臓を視覚化します。広口径の先端を取り付けたピペッターを使用して吸引圧力を加え、マウスの体から先端に心臓を吸引します。大動脈の心臓を切除して、マウスの体から採取します。

単

離した心臓を、抗凝固剤を添加した栄養豊富なバッファーを含むビーカーに浸します。緩衝液中の抗凝固剤は、心筋細胞(心筋細胞)に存在するカルシウムと複合体を形成し、心筋の収縮を停止し、血液凝固を防ぎます。

次に、心臓の頂点を下にして、適切な緩衝液を含むペトリ皿に保管された心臓スタンドに置きます。心房の上に大動脈をクランプし、クランプされた心臓を灌流プレートに移します。

続

いて、適切な灌流バッファーを含むシリンジ針アセンブリを取ります。心室を突き刺す左心室に針を挿入します。

大動脈をクランプした状態で、脳室内注射により大動脈弁が加圧されて開きます。その結果、緩衝液は冠状動脈を通して血液を順行性に洗い流し、心筋を完全に灌流します。最後に、緩衝液は肺静脈から滲出します。これにより、下流の用途に正常に灌流された心臓が提供されます。

マウスの心臓採取は、安楽死を確認し、腹部を剃った後、胸腔を素早く開いて心臓を露出させ、先端を心臓とほぼ同じ大きさにカットしたプラスチックトランスファーピペットを使用して、心臓をピペットに吸い込みます。ピペットを上げて湾曲したハサミを挿入するのに十分なスペースを作り、心房を傷つけないように注意しながら、ハサミを使用して背側から心臓を切除します。

すぐに、氷冷のCIB EGTAを入れた30ミリリットルのガラスビーカーに心臓を約1分間入れます。収縮が止まったら、氷冷したCIB EGTAを含む35ミリリットルの培養皿に心臓を入れ、肺やその他の目に見える組織を取り除きます。

大まかに洗浄した心臓を、冷やしたCIB EGTAで満たされた心臓スタンドに頂点を下にして置き、スタンドを実体顕微鏡下に置きます。大動脈の周りから脂肪と結合組織を取り除きます。切断した大動脈の長さが長すぎる場合は、腕頭動脈のすぐ下の大動脈をトリミングし、前面が前を向くように心臓の向きを合わせます。ピンセットを使用して大動脈の端を持ち上げ、小さな血管クランプを使用して心房近くの大動脈をクランプし、心房をそっと押し下げます。

次に、クランプした心臓を灌流プレートに置き、前側を上に向けて置き、数滴のCIB EGTAで心臓に水分を補給します。順行性灌流の場合は、柔軟な延長チューブとマークされた注射針に接続された予熱されたCIB EGTAを含む20ミリリットルのシリンジを輸液ポンプにロードし、毎分0.5ミリリットルの流量でポンプを始動します。針とポンプが満たされたら、注射針を灌流プレートの上に置き、斜めの短い側を前に置き、心臓の頂点にちょうど触れるまで針をスライドさせます。

慎重に

、針をねじったりプレートから外したりせずに、左心室の頂点近くに針を心室に挿入し、マークを見て針の挿入の深さを推定します。針の挿入が完了すると、冠状動脈から血液が流れ始めるはずです。

テープを使用して注射針をプレートに固定し、ポンプ速度を毎分1ミリリットルに上げます。心臓の灌流が成功すると、毛細血管内の緩衝液の流れが心外膜のすぐ下に見えるはずです。