JoVE 実験百科事典
生物学
0 回視聴 • 4:11 分 • July 8th, 2025
ブタ角膜の最内層である透明な無血管前目の部分は、基底膜であるデスメ膜(DM)によって支えられた角膜内皮細胞(CEC)で構成されています。CECは角膜の透明性と最適な視力を維持します。それらに損傷を与えると、視力に影響を与える可能性があります。
選択的なCEC損傷の場合は、適切な培地で収穫したてのブタの目から始めます。周囲の組織を取り除きます。表面の微生物汚染を除去するために、適切な消毒剤で目を治療します。生理食塩水洗浄後、レーザー照射前に前眼を光学的に検査して異常を除外します。
特定の波長のレーザーを備えた細隙灯ユニットの前にあるカスタマイズされた保持装置に目を固定します。個々の角膜層を視覚化します。適切なレーザーエネルギーと焦点位置を使用して、レーザーパルスを角膜内皮層に向けます。集束された短時間の高出力パルスは、熱拡散を避けながら露出した表面から選択的なCEC破裂を引き起こし、それによってDMまたは間質組織を保護します。
輪部 - 角膜強膜接合部の近くに入口ポートを作成し、角膜を含む前房に粘弾性溶液を注入して角膜を安定させ、残りの CEC を保護します。レーザー処理された角膜セグメントを切除し、CEC側を上に向けて培地を含むマルチウェルプレートに移します。ex vivo 角膜内皮損傷モデルは、さらなる研究に使用できます。
地元の食肉処理場から摘出されたばかりのブタの目を採取した後、サンプルを摂氏4度のフルミディアムに入れます。はさみを使用して細胞外組織を取り除き、5%ポビドンヨード点眼液に5分間目を浸します。次に、消毒したサンプルを室温で滅菌PBSに入れます。
スペクトル領域光コヒーレンストモグラフィー装置を使用して、角膜瘢痕、浮腫、その他の混濁などの主要な前眼部の病状がないか眼をスクリーニングします。スクリーニング後、波長1064ナノメートル、焦点直径10マイクロメートルのNd:YAGレーザーを搭載した細隙灯ユニットの前に目を配置します。12倍の倍率を選択し、照明を偏向させて個々の角膜層を視覚化します。
角膜内皮細胞の選択的アブレーションのための適切なパラメータにパルスエネルギーと焦点を設定した後、組織に数回のレーザーショットを適用します。次に、解剖顕微鏡下で、透明な角膜穿刺を輪部の近くに配置し、粘弾性を注入して内部チャンバーを安定させます。次に、8 ミリメートルのトレフィンを使用してレーザー処理された中央角膜を切除し、単離した角膜を内皮側を上にして 12 ウェル プレートの 1 つのウェルに入れます。すべての角膜が収集されたら、各サンプルウェルに3ミリリットルのフル培地を加え、検体を摂氏37度で最大3日間インキュベートします。