接着培養細胞に核酸を導入するためのビーズローディング:接着性哺乳動物細胞に蛍光タンパク質をコードするプラスミドをロードする技術

培養プレートで接着した哺乳類細胞を培養することから始めます。滅菌されたアルカリ処理されたミクロンサイズのガラスビーズを、カスタマイズされたビーズローダー装置のチャンバーに移します。最適なサイズの開口部を備えたメッシュを使用してチャンバーの開口部を覆い、ローディング中にビーズが通過できるようにします。イメージングチャンバーアセンブリでメッシュを固定します。

プレートからメディアを取り出します。蛍光レポータータンパク質をコードするプラスミドDNAの懸濁液をプレートにピペットで入れ、細胞全体に均一に分布させます。ビーズローダー装置を使用して、ガラスビーズの単層をセル上に穏やかに分散させます。適切な力で培養プレートを短くたたきます。

ガラスビーズは接着細胞の上に短時間転がりますが、アルカリ処理により細胞への付着性が低下します。ビーズと細胞の間の衝突の影響により、適切なひずみが伝達され、細胞膜に局所的な破壊が生じます。これらの形成された小さな寸法の一過性細孔は、大きなビーズの侵入を防ぎながら、細胞へのプラスミドDNAの取り込みを促進します。

回復期間中、細胞膜が再密閉され、膜の完全性が回復し、プラスミドDNAが閉じ込められます。プレートに培地を加え、プレートから目に見える浮遊ビーズを慎重に吸引します。プレートをインキュベートします。

プラスミドDNAを含むトランスフェクトに成功した細胞は、蛍光顕微鏡で可視化できる蛍光レポータータンパク質を発現します。

細胞から培地を取り出し、チャンバーの端の周りからすべての培地をそっと吸引します。次に、チャンバーを約45度の角度に傾け、中央のマイクロウェルに残っている培地の滴を取り除きます。ビーズローディング溶液をチャンバーの中央にあるガラスマイクロウェルにそっとピペットで移動します。

ビーズローディング装置を使用して、ガラスビーズの単層をセルの上に穏やかに分散させます。ビーズが細胞を完全に覆っていることを確認してください。2本の指でチャンバーをつまみます。約2インチ持ち上げ、その高さから皿を落とすのとほぼ同じ力でしっかりと下ろします。

チャンバーのプラスチック側にゆっくりとピペッティングして、培地をチャンバーにそっと戻します。細胞を乱すことなく、浮遊ビーズを吸引します。ビーズローディング手順全体は比較的迅速に実行する必要があるため、培地がないときに細胞が乾燥することはありません。次に、細胞をインキュベーターで0.5〜2時間インキュベートします。