Name: RNA含有エキソソームの単離と解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学ぶエキソソームの単離・精製法と電子顕微鏡・フローサイトメトリー・ウエスタンブロッティングによる解析手法。RNA含有エキソソームの機能研究に応用可能です。

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この研究は、スウェーデンの研究評議会（K2008 - 57X - 20 676-01-3）によって賄われた。

<ol><li>Pan, B. -T., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+transferrin+receptor+during+maturation+of+sheep+reticulocytes+in+vitro%3A+Selective+externalization+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: Selective externalization of the receptor.</a> Cell. 33, 967-978 (1983).</li>
<li>Chaput, N., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+immune+properties+and+potential+clinical+implementations%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: immune properties and potential clinical implementations.</a> Semin. Immunopathol. , 10-1007 (2010).</li>
<li>Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-containing+exosomes+in+human+nasal+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Rhinol.+Allergy%22%5BJournal%5D)">RNA-containing exosomes in human nasal secretions.</a> Am. J. Rhinol. Allergy. 25, 89-93 (2011).</li>
<li>Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).</li>
<li>Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5, e8577-e8577 (2010).</li>
<li>Admyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).</li>
<li>Almqvist, N., Lönnqvist, A., Hultkrantz, S., Rask, C., Telemo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-derived+exosomes+from+antigen-fed+mice+prevent+allergic+sensitization+in+a+model+of+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Serum-derived exosomes from antigen-fed mice prevent allergic sensitization in a model of allergic asthma.</a> Immunology. 125, 21-27 (2008).</li>
<li>Prado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+Bronchoalveolar+Fluid+of+Tolerized+Mice+Prevent+Allergic+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes from Bronchoalveolar Fluid of Tolerized Mice Prevent Allergic Reaction.</a> J. Immunol. 181, 1519-1525 (2008).</li>
<li>Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+established+murine+tumors+using+a+novel+cell-free+vaccine%3A+dendritic+cell-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Medicine%22%5BJournal%5D)">Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes.</a> Nature. Medicine. 4, 594-600 (1998).</li>
<li>Ashiru, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Is+Suppressed+by+Exposure+to+the+Human+NKG2D+Ligand+MICA%2A008+That+Is+Shed+by+Tumor+Cells+in+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Research%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cell Cytotoxicity Is Suppressed by Exposure to the Human NKG2D Ligand MICA*008 That Is Shed by Tumor Cells in Exosomes.</a> Cancer. Research. 70, 481-489 (2010).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Mammary+Carcinoma+Exosomes+Promote+Tumor+Growth+by+Suppression+of+NK+Cell+Function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function.</a> The Journal of Immunology. 176, 1375-1385 (2006).</li>
<li>Viaud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cell-Derived+Exosomes+Promote+Natural+Killer+Cell+Activation+and+Proliferation%3A+A+Role+for+NKG2D+Ligands+and+IL-15R%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15Rα.</a> PLoS ONE. 4, e4942-e4942 (2009).</li>
<li>Szajnik, M., Czystowska, M., Szczepanski, M. J., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Derived+Microvesicles+Induce%2C+Expand+and+Up-Regulate+Biological+Activities+of+Human+Regulatory+T+Cells+%28Treg%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tumor-Derived Microvesicles Induce, Expand and Up-Regulate Biological Activities of Human Regulatory T Cells (Treg).</a> PLoS ONE. 5, e11469-e11469 (2010).</li>
<li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996).</li>
<li>Abusamra, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+exosomes+expressing+Fas+ligand+mediate+CD8%2B+T-cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Molecules%2C+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 35, 169-173 (2005).</li>
<li>Valadi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li>
<li>Eldh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+communicate+protective+messages+during+oxidative+stress%3B+possible+role+of+exosomal+shuttle+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA.</a> PLoS One. 5, e15353-e15353 (2010).</li>
<li>Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva%2C+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA%3A+uptake+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> J. Transl. Med. 9, 9-9 (2011).</li>
</ol>

JLは、細胞へのRNAの転送のためのベクターとしてエクソソームの利用に関連する特許の共同所有者です。

分子コンテンツおよび/またはエクソソームの機能を研究するとき、それは適切な収率と汚染の可能な限り低い学位を提供する高品質の単離法を使用することが重要です。このホワイトペーパーで説明されている方法論は、エクソソームを分離し、それらのRNA含有量と生物学的機能を研究するための十分に確立されたアプローチです。さらに、孤立エクソソームの特性評価の重要性は、電子顕微鏡、フローサイトメトリー、ウェスタンブロットを含むさまざまな方法の組み合わせによって、強調表示されます。 エクソソームを分離する場合、最初の遠心分離工程（300 × gでは）細胞懸濁液または調査生物学的流体中に存在する可能性のある細胞をペレット化するために使用されます。ペレット死細胞、大きい破片、アポトーシス小体や他の細胞小器官に十分に強いものに16 500 × gでのニーズの第二遠心分離。この遠心分離の後、一部のプロトコルは、ナノろ過工程が、いくつかINVが含まれていますestigatorsは、このステップを除外している。しかし、我々は200nmよりも大きいの根絶の断片と小胞の重要性を強調するため、強く、濾過工程を含めることをお勧めします。より厳格な分離が必要な場合は、100nmのフィルターが使用されますが、高粘性流体が使用されている場合、これらのフィルタを簡単にブロックになることができるとexosomal材料が失われることに注意することができます。また、100nmのろ過は、エクソソームの形態に影響を与える可能性がありますし、さらにエクソソームが大規模にある場合、それらが失われる可能性があります。従って、200nmのフィルターは、エキソソーム分離に適しているようです。濾過後、120,000 xgで必須の超遠心分離は、ペレットエクソソームするために使用されます。エクソソームは、さらに抗体被覆ビーズに結合し、洗浄し、PBSで洗浄し、または汚染のタンパク質を除去するために、ショ糖勾配上に配置することができます。しかし、これはスタートサンプル量が小さいと/またはRNA含有量Oの場合は特に、我々は必要ではないと主張することは非常にリソースがかかる可能性がありますFエクソソームは、余分な手順は、実質的にさらに材料を減らすので、低いです。しかし、再び、隔離された小胞の性質は、特定のタンパク質の存在下および非存在によって証明されるべきである。 日付に、エクソソームには絶対的にユニークなタンパク質マーカーは、サンプルがエクソソーム、それ以外のものが含まれていることを確認するために同定されていない。その結果、方法の組み合わせは、電子顕微鏡によるエクソソームの大きさと形態の決定を含むエクソソームを、特徴づけるために必要とされています。このメソッドはそのような微粒子、アポトーシス小体や細胞の破片などの大規模な小胞、と例えば、サンプルの汚染のレベルの概要を提供することができるとしても、サンプルの純度は、電子顕微鏡によって測定することができる。また、エクソソームのタンパク質含有量（例えばCD63を結合した​​膜の両方の分析でフローサイトメトリーとウェスタンブロット法、及びこれら二つのメソッドの結果の組み合わせによって決定することができるとCD81）とエクソソームの内部化タンパク質（例えばTsg101とアリックス）。このようなCD63、Tsg101とアリックス、そしてそのような小胞体蛋白質カルネキシンのようなタンパク質の欠如など、エクソソーム、に富むタンパク質の検出は、エキソソーム濃縮ペレットが実際にエクソソームと細胞の他の区画からではない汚染する小胞であることを示しています。 エクソソームで検出されるRNAのプロファイルは、無傷の細胞で検出されたRNAのそれと根本的に異なっている。従って、バイオアナライザでまたはゲルベースの​​RNAの解析手法で分析したexosomal RNAは、細胞のRNAの解析において顕著な18Sと28S rRNAのサブユニット、の2つのピークを欠いている。したがって、サンプルのrRNAのいずれかのかなりの量の検出は、分離の方法が改善し、品質を保証する必要があることをこのように抽出したtotal RNAは単独でexosomal起源ではないことを示す、と主張する。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td> エキソソーム分離 </td></tr><tr><td>オプティマL - 90K超遠心機</td><td>ベックマンコールター</td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td>クイックシールの超遠心管</td><td>ベックマンコールター</td><td></td><td>別のチューブを使用するローターに応じて必要とされる。 Ti70（342414）、Ti45（345776） </td></tr><tr><td>クイックシールコードレスチューブトッパーキット</td><td>ベックマンコールター</td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropurシリンジフィルター、0.20μm </td><td>ザルスタット</td><td> 83.1826.001 </td><td> VWRインターナショナルからビスコース液体および/または大容量、真空ろ過システム、0.2μmの、のために（514〜0600）の代わりに使用することができます。 </td></tr><tr><td> 電子顕微鏡法 </td></tr><tr><td> Formvar /カーボンコーティングされたニッケルグリッド</td><td>テッドペラ株式会社</td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ヒトCD63 </td><td>バイオサイエンスBD </td><td> 556019 </td><td>最終濃度：0.05μg/μl </td></tr><tr><td>アイソタイプコントロール、IgG1κ（MOPC 21） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M9269 </td><td>最終濃度：0.05μg/μl </td></tr><tr><td>抗マウスIgG金共役、10nmの</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G7777 </td><td>最終濃度：1％ </td></tr><tr><td> LEO 912ABオメガ電子顕微鏡</td><td>カールツァイスNTS </td><td></td><td>または同等の装置。 </td></tr><tr><td> フローサイトメトリー </td></tr><tr><td> 4μmaldehyd /硫酸塩ラテックスビーズ</td><td>界面動力学</td><td> 12から4000 </td><td></td></tr><tr><td>ラテックスビーズのコーティング用抗体</td><td></td><td></td><td>バイオサイエンスBD（556019）からの例の抗CD63用</td></tr><tr><td>インテリミキサーRM - 2L </td><td> ELMI </td><td></td><td>または同等の装置。 </td></tr><tr><td>ヒト血清からのIgG </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td>検出用抗体</td><td>バイオサイエンスBD </td><td></td><td>たとえば、次のようにPE抗CD63（556020）PE抗CD9（555372）PE、抗CD81（555676）アイソタイプコントロール（555749） </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td>バイオサイエンスBD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ウエスタンブロット法 </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> ELMA </td><td></td><td>または同等の装置。 </td></tr><tr><td> exosomal RNAとRNA解析の分離 </td></tr><tr><td> miRCURY RNAアイソレーションキット</td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilentの2100バイオアナライザ</td><td>アジレントテクノロジー</td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

rna含有エキソソームの単離と解析

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

エキソソーム研究の分野は近年急速に出版物の劇的な増加と、拡大しています。エンドサイトーシスの起源のこれらの小胞は（30〜100 nmの）最初の赤血球1に成熟しながら、網状赤血球は、トランスフェリン受容体を根絶するための手段として機能するように提案し、後で名前エクソソームであった。エキソソームは、多胞体（MVBs）の製造、後期エンドソームの内向きの出芽によって形成され、原形質膜2 MVBsの融合により、環境中に放出されています。エクソソームの最初の発見以来、セルの広い範囲は、これらの小胞を放出することが示されている。エキソソームは、プラズマ、鼻洗浄液、唾液や母乳3月6日を含むいくつかの生物学的流体、検出されている。さらに、それはエクソソームの内容と機能は元の細胞とそれらが生成される条件に依存することが実証されている。様々な機能が悪魔となっているT細胞増殖14の刺激、制御性T細胞にそのようなアレルゲン7,8に対する寛容の誘導など、エクソソーム、、マウス9の確立された腫瘍の撲滅、ナチュラルキラー細胞10-12の抑制と活性化、分化の促進13のtratedとT細胞のアポトーシス15の誘導。 2007年に我々は、肥満細胞から放出さエクソソームは、メッセンジャーRNA（mRNA）とマイクロRNA（miRNAを）含んでいる、とRNAが1つのセルからエクソソームを経由して別のに往復することができるということを示した。レシピエントの細胞では、エクソソームで往復mRNAを転送RNA 16の調節機能を示唆し、タンパク質に翻訳されることが示された。さらに、我々はまた、酸化ストレス下で増殖した細胞から派生したエクソソームは、レシピエント細胞にさらなるストレスに対する耐性を誘導するため、exosomalシャトルRNA 17の生物学的機能を提案できることが示されている。細胞培養培地や生体液のCO小胞の混合物をntainとフラグメントを流した。エクソソームのための高品質の単離法は、特性評価およびエクソソームとそのコンテンツの識別に続いて、したがって、他の小胞と粒子からエクソソームを区別するために不可欠です。ここで、我々は、細胞培養の培地や体液の両方からエクソソームの単離のための方法を提示する。この分離法はエクソソームはペレット化されている最後の超遠心分離のステップに続いて、繰り返しの遠心分離やろ過のステップに基づいています。エクソソームを特定し、exosomal形態及び蛋白質含量を特徴づける重要なメソッドは、電子顕微鏡、フローサイトメトリーとウェスタンブロット法を含めて、強調表示されます。トータルexosomal RNAの精製はスピンカラムクロマトグラフィーに基づいており、exosomal RNAの収量とサイズ分布は、バイオアナライザを用いて分析される。

本論文では、エクソソームの単離、精製および検出のための方法、ならびにそれらの分子量の分析のためのテクニックを示しています。これらのメソッドは、細胞培養液や体液の両方からエキソソーム分離のための適応であり、分子量の分析を越えても機能的研究に役立ちます。

RNA含有エキソソームの単離と解析

エクソソーム研究の分野は急速に拡大しており、近年、論文数も劇的に増加しています。これらの小さな小胞（30～100 nm）は、...

本実験の全体的な目的は、目的の細胞および生物学的流体において、exosomeを含むRNAが放出または含有されているかを確認することである。exosomeを単離するための最初のステップは、細胞および細胞残渣を除去することである。次に、上清をろ過してより大きな粒子を除去する。次に、2番目のステップとして、超遠心分離によってエクソソームをペレット化します。単離された小胞がエクソソームの形態、サイズ、およびタンパク質組成を有していることを示すため、電子顕微鏡、フローサイトメトリー、およびウェスタンブロット分析を用いてエクソソームを特性評価します。その後、精製したエクソソームからRNAを単離します。エクソソームがどのRNAを含んでいるかを決定するために、エクソソームの精製、検出、および特性解析に用いられるこれらの確立された手法で得られた結果は、生物学的機能などのエクソソームに関するさらなる研究を促進させることができます。したがって、本プレゼンテーションでは、さまざまな方法でエクソソームを単離する方法について説明します。発表は私の博士課程の学生であるMariaとCeceliaの2名が行います。それでは、よろしくお願いします。エクソソーム分離の手順を開始するため、本エクソソーム分離のデモンストレーションでは、ヒトマスト細胞株HC-1を使用します。まず、エクソソーム除去血清を含む培地で細胞を培養します。次に、細胞懸濁液をコニカルチューブに移し、4 °Cで300 ×g、10分間遠心分離します。細胞をペレット化するため、上清を超遠心チューブに移し、4°Cで16,500 ×gにて20分間遠心分離し、細胞および細胞残渣をさらに除去します。次に、0.2 µmフィルターで上清をろ過し、200 nmより大きい粒子をさらに除去します。最後に、ろ過後の上清が入った超遠心チューブを密閉し、4°Cで120,000 ×gにて70分間超遠心分離して、エクソソームをペレット化します。超遠心管を切断して開封し、上清を捨て、エクソソーム濃縮ペレットを再懸濁させることでエクソソームを回収します。エクソソームを最大限に回収するためには、適切なバッファーを少量用いて、エクソソーム濃縮ペレットをエンドターフチューブ内で繰り返し再懸濁させてください。前回と同量のバッファーで2回洗浄します。使用するバッファーは、エクソソーム分離後の実験内容に応じて選択してください。電子顕微鏡観察には、未処理のエクソソームから得られたエクソソームタンパク質を約10 micrograms使用します。PBSで再懸濁を行います。エクソソームはサイズと形態のみで識別可能なため、カーボンコートニッケルグリッドを用いた電子顕微鏡観察は免疫染色なしで実施できます。ただし、anti CD 63やanti MHC Class twoなどの一次抗体を使用し、続いて10 nmの金標識二次抗体を用いることが推奨されます。エクソソームは現在のフローサイトメトリー装置では検出するには小さすぎるため、まずエクソソームを抗体コーティングビーズに結合させる必要があります。エクソソームの細胞由来に応じて、異なる抗体が磁性ビーズまたはラテックスビーズに結合されています。このデモンストレーションでは、各サンプルにanti CD 63コーティングラテックスビーズを使用します。無傷のエクソソームの量として、エクソソームタンパク質30～40 µgに相当する体積を使用します。PBSに懸濁し、エクソソームをビーズとともに4 °Cで緩やかに撹拌しながら一晩インキュベートします。翌日、200 mMグリシンを300 µL添加してブロッキングを行い、30分間インキュベートします。エクソソームビーズ複合体を洗浄バッファーで2回洗浄し、50 µLのIgG抗体とともに4 °Cでインキュベートします。エクソソームビーズ複合体をさらに2回洗浄し、90 µLの洗浄バッファーと10 µLの任意の抗体を追加して、暗所で40分間インキュベートします。緩やかに攪拌しながらエクソソームビーズ複合体を2回洗浄し、300 µLの洗浄バッファーを加えてサンプルをフローサイトメトリー用チューブに移し、フローサイトメトリーを用いてデータを取得します。このウェスタンブロットのデモンストレーションでは、ウェスタンブロット前における適切なタンパク質単離の重要性と、使用するさまざまな抗体について焦点を当てます。エクソソームペレットを選択したタンパク質溶解バッファーに溶解し、ピペッティングで十分に混ぜた後、ボルテックスミキサーでさらにエクソソームを溶解させます。サンプルをウォーターバスで超音波処理し、13,000 ×g で5分間遠心分離して、上清を新しいエペンタールチューブに移します。任意の法で総タンパク質量を測定し、タンパク質をゲルにロードします。次に、ゲル電気泳動およびエレクトロブロッティングによってタンパク質を分離・転写し、メンブレンをブロッキングおよび洗浄します。エキソソーム特異的なマーカーは存在しないため、エキソソームに濃縮されているタンパク質に対する免疫染色を行います。あらゆる異なる細胞由来のエキソソームに濃縮されているタンパク質が、一般にエキソソームの検出に用いられます。これらはテトラスパニンなどのタンパク質であり、例えば CD9、CD63、および CD81 が挙げられます。ezrinなどの細胞骨格関連タンパク質や、TSG 1 0 1およびLYなどのマルチベシキュラーバイオジェネシスに関与するタンパク質を使用する一方で、陰性コントロールとして、小胞体由来のkexinやGRP 78など、他のコンパートメントの小胞に一般的に見られる混入タンパク質を確認します。予定している実験に応じて、さまざまなRNA抽出キットを使用できます。本デモンストレーションでは、RNA抽出の際にカラム法を用います。核酸およびヌクレアーゼフリーのピペットチップを使用し、ベンチと器具の両方を汚染物質およびRNAがない状態に拭き上げることが重要です。エクソソームペレットを350 µLの溶解液に溶解し、サンプルをボルテックスします。200 µLの95% ethanolを加え、ボルテックスを用いて混合します。カラムをコレクションチューブにセットし、溶解したエクソソームをカラムに移して遠心分離します。洗浄溶液400 µLで3回洗浄し、カラムを十分に乾燥させます。最後の洗浄後、14,000 ×gで2分間遠心分離し、乾燥したカラムをRNaseフリーのEPチューブに移します。抽出した総エクソソームRNAの検出および分析のため、50 µLの溶出バッファーでRNAを溶出させます。エクソソームは、既存のフローサイトメトリー法では検出するには小さすぎるため、RNA 6,000 nanoキットまたはRNA 6,000 picoキットを用いてAgilent 2100バイオアナライザで分析できます。分析前に、エクソソームは抗体コートビーズに結合させます。これらのエクソソーム・ビーズ複合体は凝集する可能性があるため、フローサイトメトリーの散布図には、単一、二重、および三重のエクソソーム・ビーズ複合体という異なる集団が含まれる場合があります。ここで示されているように、矢印は単一のエクソソームビーズ複合体の集団を示しており、この集団がさらに解析されます。フローサイトメトリーのヒストグラムは、CD 63タンパク質陽性の単一エクソソームビーズ集団を示しています。開いた曲線が右にあるほど、サンプルはCD 63に対してより陽性であることを意味します。エキソソームはサイズが非常に小さいため、電子顕微鏡でしか視覚化できません。エキソソームの典型的な形態学的特徴は、直径 30 to 100 nanometer の球状小胞であることです。CD 63 に対する金標識抗体を用いたエキソソームの免疫染色が、矢印で示されたウェスタンブロットに表示されています。結果から、エクソソームサンプルには小胞体タンパク質であるcalnexinが存在せず、一方でエクソソームに一般的に濃縮されているタンパク質であるテトラスパニンCD 81が存在することが示されました。細胞RNAは主にリボソームRNAを含んでおり、このバイオアナライザー解析では、左側に18 sリボソームRNAサブユニット、右側に28 sサブユニットの2つのピークとして確認できます。対照的に、エクソソームRNAはプロファイルが異なり、リボソームRNAをほとんどまたは全く含まない一方で、メッセンジャーRNAやマイクロRNAなどの短いRNAが濃縮されています。正しく行えば、分離はおよそ3時間で完了します。この方法を用いる際は、より大きなICの混入を防ぐため、非ろ過工程を含むすべてのステップを確実に実行することが重要です。この技術の開発により、エクソソームの生化学的および生物学的な特性解析が大幅に容易になりました。さらに、さまざまな系におけるエクソソームを介した細胞間コミュニケーションについて、多くの知見が得られています。また、この技術により、さまざまな疾患のバイオマーカーとしてエクソソームを開発することが可能となりました。ご清聴ありがとうございました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

エキソソーム中の安定したマイクロRNA（miRNA）はの存在は、バイオマーカーとして、また治療的介入のためのルートとしての潜在的有用性のために、細胞間コミュニケーションの新たなモードとして莫大な利益を生成しました。ここでは、搬送中のmiRNAを識別するために、定量PCRに続いて、血液や文化メディアからエキソソーム浄化を示しています。...

血と文化メディア由来エキソソームの精製およびマイクロRNAプロファイリング

ヒト免疫不全ウイルス(HIV)粒子からエクソソームを分離する勾配手順を説明する技術が説明されています。この手順は、HIV感染者のヒト血漿中のHIV粒子からエキソソームを分離するために使用されました。単離されたエキソソームは、サイトカイン/ケモカイン含有量について分析されました。...

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胆汁液は、潜在的に重要なバイオマーカーを含む細胞外小胞/エクソソームの貴重な供給源です。このプロトコルは、miRNAプロファイリングを含むさらなる分析のために、ヒトの胆汁からエキソソームを単離するための堅牢な方法を表しています。...

ヒト胆汁からマイクロRNA含有エキソソームの単離とプロファイリング

内生的に形成された mRNA 蛋白質複合体の回復のためのタンデムの RNA 分離手順 (旅行) を説明します。具体的には、RNA 蛋白質の複合体は、生体内で架橋 polyadenylated Rna ランダムプライマー ビーズ抽出物から分離された、特定の Mrna が変更された RNA アンチセンス オリゴヌクレオチドでキャプチャされます。イムノブロット解析による蛋白質の Mrna...

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

限外ろ過遠心分離法を用いたマウスの気管支肺胞洗浄液細胞小胞の分離

このプロトコルは、小さな RNA ライブラリーの構築と次世代シーケンシングのための細胞培養媒体からマイクロ Rna は細胞を浄化する方法を示します。さまざまな品質管理のチェックポイントは、exRNAs...

分離、シーケンスおよびヒト間葉系幹細胞からの細胞のマイクロ Rna を分析

エキソソームが医薬品配送事業者の新世代です。高収量とによる siRNA デリバリーのための純度エキソソームの隔離のプロトコルを設立しました。また、エクソソームに蛍光標識非特異的 siRNA をカプセル化し、がん細胞で siRNA ロード...

がん細胞への siRNA のエクソソームの準備

このプロトコルは1)大人マウス腓腹筋からの第一次線維芽細胞の隔離そして文化、また2)西部のしみの分析に先行しているスクロース密度勾配と結合される差動ultrarifjugeation方法を使用してexosomesの浄化そして性格描写を示す。...

骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価

ここでは、コラゲナーゼI型による消化と超遠心分離の組み合わせを使用して、マウス脾臓由来エクソソームを単離するプロトコールを紹介します。...

マウス脾臓組織由来エクソソームの単離と特性評価

この作品は、染色体レベルでのRNA /...

RNAを含むオリゴヌクレオチドを​​使用して変換によるゲノムDNAのRNA / DNAハイブリッドの世代

学ぶエキソソームの単離・精製法と電子顕微鏡・フローサイトメトリー・ウエスタンブロッティングによる解析手法。RNA含有エキソソームの機能研究に応用可能です。

RNA含有エキソソームの単離と解析

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