RNA含有エキソソームの単離と解析

次の実験の全体的な目標は、目的の細胞や体液がエキソソームを含むRNAを放出するか、または含むかを決定することです。エクソソームを単離する最初のステップは、細胞と細胞の破片を取り除くことです。次に、スーパーナットをろ過して、より大きな粒子を除去します。

次に、エクソソームは、第2のステップとして超遠心分離によってペレット化されます。エキソソームは、電子顕微鏡法、フローサイトメトリー、およびウェスタン血液分析によって特徴付けられ、単離された小胞がエキソソームの形態サイズとタンパク質組成を有することを示しています。次に、精製されたエクソソームからRNAが単離されます。

どのRNAがエキソソームに含まれているかを決定するために、エキソソームの精製検出および特性評価のためのこれらの確立された方法によって得られる結果は、それらの生物学的機能などのエキソソームのさらなる研究を容易にすることができます。このプレゼンテーションでは、エクソソームがさまざまな方法で分離する方法と、私の博士課程の学生であるMaria、El、Ceceliaの2人を紹介します。えー、頑張ってください。

ヒト質量細胞株であるHC oneは、このエキソソーム単離のデモンストレーションに使用され、エキソソームを単離する手順を開始します。まず、エキソソーム遊離血清を含む培地で細胞を増殖させます。次に、細胞懸濁液を円錐形のチューブに移し、Gの300倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。

細胞をペレット化するには、スーパーネームを超遠心チューブに移し、サンプルを16、500倍Gで摂氏4度で20分間遠心分離して、細胞と細胞の破片をさらに除去します。次に、0.2ミクロンのフィルターでSANEをろ過し、200ナノメートルを超える粒子をさらに除去します。最後に、濾過された正気を含む超遠心チューブを超遠心分離機に120,000倍Gで4°Cで70分間密封し、エキソソームをペレット化する。

エクソソームは、超遠心チューブを切り開き、スナットを廃棄し、エキソソームが豊富なペレットを懸濁させることによって回収されます。最大限のエキソソーム検索のために。Resusは、エキソソームが豊富なペレットを少量の適切な緩衝液中に繰り返し懸濁し、eendオーフチューブに入れます。

前回と同じ容量の追加のバッファーで2回すすいでください。バッファーは、エキソソームを追う実験の種類によって異なります。隔離。電子顕微鏡法では、無傷のエキソソームから約10マイクログラムのエクソソームタンパク質を使用します。

PBSで再懸濁しました。当社のカーボンコーティングニッケルグリッド電子顕微鏡は、エクソソームをサイズ形態のみに基づいて同定できるため、免疫染色なしで行うことができます。ただし、抗CD63や抗MHCクラス2などの一次抗体を使用し、その後に10ナノメートルの金標識二次抗体を使用することをお勧めします。

エクソソームは現在のフローサイトメトリー装置では検出できないほど小さいため、まずエクソソームを抗体でコーティングしたビーズに結合させる必要があります。エキソソーム細胞の起源に応じて、異なる抗体が磁気ビーズまたはラテックスビーズに結合します。このデモンストレーションでは、各サンプルに抗CD63コーティングラテックスビーズを使用します。

無傷のエキソソームの30〜40マイクログラムのエキソソームタンパク質に等しい容量を使用してください。.PBSに懸濁したエキソソームをビーズにインキュベートし、穏やかな動きで摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、300マイクロリットルの200ミリモルグリシンを加えてブロックし、30分間インキュベートします。

エキソソームビーズ複合体を2回洗浄し、洗浄バッファーを50マイクロリットルのIgG抗体と摂氏4度でエキソソームビーズ複合体をインキュベートします。エキソソームビーズ複合体を2回洗浄し、90マイクロリットル、洗浄バッファー、および選択した10マイクロリットルの抗体をエクソームビーズ複合体に加え、暗所で40分間インキュベートします。穏やかな動きで、エクソームビーズ複合体を2回洗浄し、300マイクロリットルの洗浄バッファーを添加し、サンプルをフローサイトメトリーチューブに移し、フローサイトメトリーを使用してデータを取得します。

このウェスタンブロットのデモンストレーションでは、ウェスタンブロットの前の適切なタンパク質単離の重要性と、使用されるさまざまな抗体に焦点を当てます。選択の蛋白質のlysisのパフの蛋白質のlyのパフでエキソソームのペレットを分解し、十分にピペットをピペットで渦で混合し、水浴のサンプルを5分間13、000回G遠心分離機にサンプルを超音波処理し、新しいeinorの管にSANEを移す。選択した方法で総タンパク質を測定し、タンパク質をゲルにロードします。

次に、ゲル電気泳動とエレクトロブロッティングによりタンパク質を分離して転写し、エキソソーム特異的マーカーがないため、エクソソームが豊富なタンパク質に対して免疫染色を行う前に、メンブレンを洗浄します。エキソソームの検出には、すべての異なる細胞起源のエキソソームに富むタンパク質が一般的に使用されます。これらは、テトラスパニンなどのタンパク質、例えば、CD nine、CD 63、およびCD 81です。

エズリンなどの細胞骨格関連タンパク質や、TSG 1 0 1、LYなどの多胞生合成に関与するタンパク質は、小胞体からのケキシンやGRP 78などの他のコンパートメントからの小胞に一般的に見られる汚染タンパク質のネガティブコントロールチェックとして。計画された実験に応じて、異なるRNA単離キットを使用することができます。このデモンストレーションでは、RNA単離を行う際にカラムベースの方法を使用します。

核酸およびヌクレアーゼフリーのピペットチップを使用し、ベンチと機器の両方に汚染物質やRNAが付着しないように拭くことが重要です。エキソソームペレットを350マイクロリットルの溶解液に溶解し、サンプルをボルテックスします。200マイクロリットルの95%エタノールを加え、ボルテックスを使用して混合します。

コレクションチューブにカラムを置き、溶解したエキソソームをカラムに移し、400マイクロリットルの洗浄液で3回遠心分離Washして、カラムが乾燥していることを確認します。最後の洗浄後、14, 000倍Gで2分間遠心分離し、乾燥カラムをRNAフリーのeend rphチューブ溶出物に入れます。抽出された総エキソソームRNAの検出と分析のための50マイクロリットルのelucianバッファー中のRNA。

Agilent 2100バイオアナライザーは、エキソソームが小さすぎて利用可能なフローサイトメトリー法で検出できないため、RNA 6, 000ナノまたはRNA 6, 000ピコキットと一緒に使用できます。それらは分析される前に抗体コーティングされたビーズに付着します。これらのエキソソームビーズ複合体はフローサイトメトリーを凝集させることができるため、散布図には、シングル、ダブル、トリプルのエキソソームビーズ複合体の異なる集団を含めることができます。

ここに示すように、矢印は1つのエキソソームビーズ複合体の集団を示しており、これはさらに分析される集団です。フローサイトメトリーヒストグラムは、CD 63タンパク質に対して陽性の単一のエキソソームビーズ集団を示しています。開いた曲線が右にあるほど、サンプルはCD 63に対してより正です。

エクソソームのサイズが小さいため、電子顕微鏡でしか可視化できません。エクソソームの典型的な形態学的特徴には、30〜100ナノメートルサイズの丸い形状の小胞が含まれます。CD 63に対する金リベラル抗体を用いたエキソソーム免疫染色は、Arrow Westernブロットで示されています。

結果は、エキソオマールサンプル中に小胞体タンパク質カルネキシンが存在しないことを示していますが、エキソソームが一般的に豊富なタンパク質であるCD81にはテトラスパンが存在することを示しています。細胞RNAは主にリボソームRNAを含んでおり、このバイオアナライザー分析では、左に見える18 sリボソームRNAサブユニットと右に見られる28 sサブユニットの2つのピークとして見られます。しかし、エキソソマRNAは、リボソームRNAをほとんどまたはまったく含まず、要するに、メッセンジャー、RNA、マイクロRNAなどのRNAを習得すると、そのプロファイルが異なります。

の分離は、正しく行えば約3時間で行うことができます。この方法を使用する間は、より大きなICの汚染を避けるために、ノンファイリングを含むすべての手順を実行することが重要です。この技術の開発後、エクソソームを生化学的にも生物学的にも特徴づけることがはるかに容易になりました。

さらに、さまざまなシステムにおけるエキソソームを介した細胞間コミュニケーションについても、さらに多くのことを学びました。また、この技術により、さまざまな疾患のバイオマーカーとしてエクソソームを開発することが可能になりました。ご清聴ありがとうございました。