Mobility Shift Affinity Capillary Electrophoresis:タンパク質-リガンド複合体の異なる移動に依存するサンプル-リガンド相互作用の解析法

金属イオンなどのリガンドは、特定のタンパク質に非共有結合して、タンパク質-金属イオン複合体を形成します。この結合によりタンパク質の全体的な電荷が変化し、アフィニティーキャピラリー電気泳動を使用してこれらの複合体の特性評価が可能になります。

まず、内面に荷電したシラノール基を備えた、前調整された薄いガラス毛細管を取ります。毛細血管をEDTA溶液ですすいでください。EDTAは、金属イオンの不純物を除去するキレート剤です。次に、目的のタンパク質を含むサンプル溶液を、その正端または陽極からキャピラリーに流体力学的に注入します。

高電圧を印加して電気浸透流を発生させ、固有の電荷を持つ天然コンフォメーションのタンパク質をキャピラリー内をカソードに向かって移動させます。キャピラリーからの結合していないタンパク質の移動パターンを記録します。

次に、タンパク質サンプルと一緒に特定のリガンド溶液をキャピラリーに導入し、同じ電圧を印加します。毛細管内では、リガンド分子が標的タンパク質に非共有結合し、複合体を形成します。

これにより、タンパク質のコンフォメーション変化が誘発され、タンパク質固有の電荷が変化し、電荷対サイズ比に影響を与えます。これらの変化は、毛細管の荷電表面との相互作用を調節し、結合していないタンパク質と比較して異なる流れを引き起こします。

タンパク質とリガンドの相互作用の強さと相関する電気泳動移動度のこれらの変化を記録します。

リガンドを使用しない測定方法を準備した後、最初に0.1モルのEDTA溶液を使用して毛細管管を2.5バールで1分間すすぎ、リガンドを使用した測定方法を準備します。次に、脱イオン水を使用して毛細管をすすぎます。次に、リガンド溶液を使用して毛細管を2.5バールで1.5分間すすぎ、キャピラリーを平衡化します。

次に、アセトアニリド溶液を0.05バールで6秒間注入し、入口バイアルと出口バイアルをリガンド含有バッファーバイアルに変更します。アセトアニリド溶液をキャピラリーの先端からさらに押し込むために、0.05バールを2.4秒間適用します。10.0キロボルトを6分間印加し、200ナノメートルの波長でアセトアニリドピークを検出します。

前のようにEDTA、脱イオン水、リガンド溶液で毛細管をすすぎた後、タンパク質サンプルを注入し、入口バイアルと出口バイアルを新しいリガンド含有バッファーバイアルに変更します。最終的に、リガンドの有無にかかわらず測定を繰り返します。