JoVE 実験百科事典
生物学的技法
0 回視聴 • 6:59 分 • July 8th, 2025
マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、プロペプチドドメインと触媒ドメインを含むマルチドメインプロテアーゼであり、特定の細胞によって不活性酵素またはチモーゲンとして分泌されます。触媒ドメインの亜鉛イオンとプロペプチドドメインのシステイン残基の間の相互作用により、MMPは不活性なままになります。
ザイモグラフィーゲル電気泳動によって細胞培養上清中のMMPを検出するには、ゲルカセットを含む電気泳動タンクにドデシル硫酸ナトリウムまたはSDS含有ランニングバッファーを充填します。
ローディングバッファーと混合した培養上清、続いてタンパク質標準物質を、MMP特異的タンパク質基質と共重合したポリアクリルアミドゲルのウェルにロードします。
負に帯電した界面活性剤であるSDSは、非還元条件下でMMPのシステインと亜鉛の相互作用を破壊し、負の電荷を与えながらタンパク質を変性させます。
電気泳動を行います。電場により、負に帯電したタンパク質が正に帯電したアノードに向かって移動し、タンパク質のサイズベースの分離が引き起こされます。
電気泳動後、ゲルを非イオン性界面活性剤含有再生バッファーで処理します。非イオン性界面活性剤はSDSに取って代わり、タンパク質を再生し、MMP活性を部分的に回復させます。MMP はさらに、完全にアクティブな状態に処理されます。
MMP活性に不可欠な二価金属カチオンを含む開発バッファーでインキュベートします。活性MMPは、カチオンとともに、ゲル中のMMP基質を消化します。ジェルを洗浄して消化された生成物を取り除きます。ジェルを染色します。
MMP基質を欠いたMMP活性の領域は、未消化の基質の濃い青色の背景に対して透明なバンドとして現れます。適切なソフトウェアを使用すると、ゲルバンド強度をMMP活性と相関させることができます。
このプロトコルの開始前に、酵素の機能を維持するために、すべてのマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)を適切に調製します。サンプルはすぐに使用することも、摂氏-80度で保管することもできます。ここでは、ゼラチナーゼAまたはIV型コラゲナーゼとしても知られるMMP-2を使用して、ザイモグラフィーによるMMP活性の視覚化を実証します。
MMP酵素が調製されたら、カセット内にゲルを含む10%ゼラチンザイモグラムゲルパウチを入手します。カセットを脱イオン水ですすいでください。カセットの下部から保護テープをはがし、ゲルの上部からコームをはがします。ウェルをTris-Glycine SDSランニングバッファーで3回すすぎます。
ゲルをミニセル電気泳動装置に入れ、カセットの小さい方の側が内側を向くようにします。ゲルテンションウェッジでゲルを所定の位置にロックします。装置の上部チャンバーに、ウェルのレベルより上のTris-Glycine SDSランニングバッファーを入れ、漏れがないか確認します。ゲル電気泳動セットアップの下部チャンバーにもランニングバッファーを入れます。
次に、10マイクロリットルのタンパク質分子マーカーをロードします。
同量のサンプルを、還元剤を含まないゲルローディングバッファーに混合します。通常のSDS-PAGEとは異なり、サンプルを沸騰させず、代わりにゲルローディングチップを使用してゲルのウェルに直接ロードします。これらの井戸は最大20マイクロリットルの容量を保持できます。
ミニセルに蓋を置き、電極コードを電源に接続します。電源をオンにし、ゲルを125ボルトで90分間一定に動作するように設定します。下部チャンバーのワイヤーに電流循環を示す小さな気泡が形成されているかどうかを確認します。
最初のゲルを実行するときは、ローディングバッファーに含まれるブロモフェノールブルーをインジケーターとして使用して、15分ごとに移動の進行状況を監視します。各ゲルについて、100ミリリットルの1Xザイモグラム再生バッファーと200ミリリットルのザイモグラム開発バッファーを、どちらも脱イオン水中で調製します。
ブロモフェノールブルートラッキング色素がゲルの底に到達したら、電源をオフにします。
ミニセルを開き、ゲルを取り除きます。ジェルナイフを使用してカセットの両側を分離します。角を切ってジェルの方向をマークします。カセットからゲルを慎重に取り出し、100ミリリットルの再生バッファーの入った容器に入れます。
ゲルを室温で30分間、穏やかに撹拌しながらインキュベートします。
再生バッファーを取り除き、100ミリリットルの現像バッファーをゲルに加えます。穏やかに撹拌しながら室温で30分間インキュベートします。
次に、現像バッファーを除去し、さらに100ミリリットルの新鮮な現像バッファーをゲルに加えます。ゲルを摂氏37度で一晩インキュベートします。
一晩インキュベートした後、現像バッファーを除去し、室温で5分間、穏やかに攪拌しながら脱イオン水でインキュベートしてゲルを洗浄します。この洗浄を2回繰り返します。
ジェルをプラスチックシートプロテクターの上に置き、気泡を取り除きます。次に、フォトスキャナーでゲルをスキャンし、ゲル染色後にほとんど見えなくなるため、タンパク質標準バンドの正確な位置を保存します。
20ミリリットルのSimplyBlue SafeStainをゲルに加えて、ゲルを染色します。ゲルを室温で1時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートします。
SimplyBlue SafeStainを取り除き、室温で100ミリリットルの脱イオン水で穏やかに撹拌しながらゲルを脱色します。
1時間後、新鮮な脱イオン水と交換し、ゲルを少なくとも1時間インキュベートし続けます。