Zymographyゲル電気泳動:酵素活性を評価することによりマトリックスメタロプロテイナーゼを検出する電気泳動技術

マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、プロペプチドドメインと触媒ドメインを含むマルチドメインプロテアーゼであり、特定の細胞によって不活性酵素またはチモーゲンとして分泌されます。触媒ドメインの亜鉛イオンとプロペプチドドメインのシステイン残基の間の相互作用により、MMPは不活性なままになります。

ザイモグラフィーゲル電気泳動によって細胞培養上清中のMMPを検出するには、ゲルカセットを含む電気泳動タンクにドデシル硫酸ナトリウムまたはSDS含有ランニングバッファーを充填します。

ローディングバッファーと混合した培養上清、続いてタンパク質標準物質を、MMP特異的タンパク質基質と共重合したポリアクリルアミドゲルのウェルにロードします。

負に帯電した界面活性剤であるSDSは、非還元条件下でMMPのシステインと亜鉛の相互作用を破壊し、負の電荷を与えながらタンパク質を変性させます。

電気泳動を行います。電場により、負に帯電したタンパク質が正に帯電したアノードに向かって移動し、タンパク質のサイズベースの分離が引き起こされます。

電気泳動後、ゲルを非イオン性界面活性剤含有再生バッファーで処理します。非イオン性界面活性剤はSDSに取って代わり、タンパク質を再生し、MMP活性を部分的に回復させます。MMP はさらに、完全にアクティブな状態に処理されます。

MMP活性に不可欠な二価金属カチオンを含む開発バッファーでインキュベートします。活性MMPは、カチオンとともに、ゲル中のMMP基質を消化します。ジェルを洗浄して消化された生成物を取り除きます。ジェルを染色します。

MMP基質を欠いたMMP活性の領域は、未消化の基質の濃い青色の背景に対して透明なバンドとして現れます。適切なソフトウェアを使用すると、ゲルバンド強度をMMP活性と相関させることができます。

このプロトコルの開始前に、酵素の機能を維持するために、すべてのマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)を適切に調製します。サンプルはすぐに使用することも、摂氏-80度で保管することもできます。ここでは、ゼラチナーゼAまたはIV型コラゲナーゼとしても知られるMMP-2を使用して、ザイモグラフィーによるMMP活性の視覚化を実証します。

MMP酵素が調製されたら、カセット内にゲルを含む10%ゼラチンザイモグラムゲルパウチを入手します。カセットを脱イオン水ですすいでください。カセットの下部から保護テープをはがし、ゲルの上部からコームをはがします。ウェルをTris-Glycine SDSランニングバッファーで3回すすぎます。

ゲルをミニセル電気泳動装置に入れ、カセットの小さい方の側が内側を向くようにします。ゲルテンションウェッジでゲルを所定の位置にロックします。装置の上部チャンバーに、ウェルのレベルより上のTris-Glycine SD