クエン酸シンターゼ活性アッセイ:ショウジョウバエ組織ホモジネート中のミトコンドリアクエン酸シンターゼ活性を測定するための比色アッセイ

ミトコンドリア内では、ミトコンドリア内膜のマトリックスに局在するクエン酸シンターゼは、アセチル補酵素Aとオキサロ酢酸の間の反応を触媒してクエン酸を形成する律速酵素であり、クエン酸回路の最初のステップです。

クエン酸シンターゼ活性を分析するには、ミトコンドリアに豊富に含まれる成虫ショウジョウバエの胸部を、エチレンジアミン四酢酸、EDTA、および非イオン性界面活性剤を含む冷却抽出バッファーで満たされたチューブに移します。

氷上で胸部組織を均質化して、熱媒介タンパク質の変性を防ぎます。加えられたせん断力は、界面活性剤と組み合わせて組織を溶解し、ミトコンドリアを含む細胞内成分を放出します。

さらに、ミトコンドリア内膜の破裂は、クエン酸シンターゼを含むミトコンドリアマトリックスタンパク質の放出につながります。EDTAは二価カチオンに結合し、プロテアーゼ活性を阻害し、それによってタンパク質の分解を防ぎます。

抽出バッファーを使用してホモジネートを希釈し、マルチウェルプレートのウェルを含む反応混合物に適切な容量を加えます。反応混合物は、アセチル補酵素A、オキサロ酢酸、およびジチオニトロ安息香酸を含む。

ホモジネート中のクエン酸シンターゼは、オキサロ酢酸とアセチル補酵素Aの間の反応を触媒し、チオール基を持つクエン酸と補酵素Aを形成します。チオール基は無色のジチオニトロ安息香酸と反応し、黄色の生成物であるチオニトロ安息香酸を形成します。

マイクロプレートリーダーを使用して、黄色の溶液の吸光度を測定します。吸光度は、組織ホモジネートにおけるクエン酸シンターゼ活性に関連している可能性があります。

10匹の成虫のハエ胸部を100マイクロリットルの氷冷抽出バッファーにすぐに移し、氷上の乳棒で均質化します。氷上で5〜10秒間均質化し、氷上に5秒間置いてから、すべての組織が完全に均質化されるまで繰り返して、サンプルを冷たく保ちます。

均

質化された各サンプルの10マイクロリットルをタンパク質含有量測定用の新しいチューブに分注し、これらのチューブも氷上に保ちます。残りの各サンプルに400マイクロリットルの氷冷抽出バッファーを加え、総量500マイクロリットルにし、ピペットで上下にゆっくりと混合します。

反応ごとに、1マイクロリットルの希釈細胞ライセートを、新しく調製した反応溶液150マイクロリットルに加えます。気泡の形成を避けながら、穏やかにピペッティングして十分に混合します。次に、プレートリーダーを使用して、摂氏25度で4分間、10〜30秒ごとに412ナノメートルの吸光度を測定します。

データを時間の経過に伴う吸光度としてプロットし、曲線の線形部分の傾きを計算します。最後に、反応速度または傾きをサンプルタンパク質濃度で割って、クエン酸シンターゼ活性を正規化します。