Name: 腫瘍細胞のVasculogenic活性を評価するためにマトリゲルベースのチューブ形成アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min
Description: 学ぶマトリゲルベースのチューブ形成アッセイを用いて、腫瘍細胞の血管新生活性をin vitroで評価する方法です。U87やB16-F1などの細胞を用いて、in vivoでの血管形成能を測定し、がん治療戦略の開発に貢献します。

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1。腫瘍細胞のVasculogenic活性を評価するためにマトリゲルベースの​​チューブ形成アッセイ<ol><li>腫瘍細胞と微小血管内皮細胞の調製：そのようなU87細胞、メラノーマ細胞B16F1、乳癌MDA - MB - 435、および結腸細胞HCT116、脳の腫瘍細胞（10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で増殖させたインビトロジェンからすべての）。内皮細胞株ヒト微小血管内皮細胞（HMVECs）は1μg/ mlのヒドロコルチゾン、1 ng / mlの上皮増殖因子、10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したEBM2培地（ロンザ）で培養した。細胞をPBSで3回洗浄し、0.05％トリプシン/ EDTA（Invitrogen）で剥離した。 5分間、2000回転で遠心後、細胞ペレットをPBSで再度洗浄した。その後、ペレット化した細胞を、血球計でカウントした。 </li><li>マトリゲルの準備：成長因子-減のアリコートマトリゲル（BDバイオサイエンス）を室温で暖めていた。完全に融解する前に、それを氷上に移し、その液体は、少なくとも10分間氷上で保存した。その後、マトリゲル50μlのマトリゲルが均一に分散させることができる水平レベルで96ウェルプレートに播種し、37℃で30分間インキュベートした。 </li><li>チューブの形成：細胞は（1〜2 × 10 4）内皮細胞の腫瘍細胞やEBM - 2の無血清DMEMに再懸濁し、およびマトリゲルの先頭にロードされました。このアッセイは、尿細管の開発にいくつかの薬剤の効果を測定するために使用された場合、これらのエージェントは、（促進剤または阻害剤）無血清培地に追加されました。各条件グループは4-6井戸が含まれていました。 </li><li>画像とデータ解析：37℃でインキュベーション℃で一晩、各ウェルは、直接顕微鏡で分析した。尿細管が固定のために必要だった場合、10％ホルマリン生理食塩水ベースの溶液100μlを静かに追加された、10分後、それは分析のための準備ができていた。 10倍の位相差を持つ顕微鏡下で、各フィールド内の細管は、画像化したと各ウェル3-5確率場から尿細管の平均を計測した。 </li></ol> 2。代表的な結果： これらの細管が多角形のネットワークを形成するために接続する明確な細長い細胞体から開発されたとしてHMVECsは、陽性対照として使用した。 B16F1、U87、およびMDA - MB - 435細胞は、HMVECsによって形成されたものと同様の血管の細管を開発したが、HCT116細胞は（図1）しなかった。細胞の用量依存性の管腔形成はU87細胞でテストされました。図2に示すように、10,000個の細胞は中止細管を形成した。細胞が倍増された後は、固体血管網はHMVECsに見られるものに匹敵するものであった。対照的に、5,000未満の細胞は、血管の表現型を形成するために失敗しました。 <img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> HMVECs、U87、MDA - MB - 435、およびB16F1細胞ではなく、HCT116細胞により誘導される図1。 チューブの形成。全ての細胞（2 × 10 4）マトリゲル上にロードし、一晩インキュベートした。細管は、位相コントラストを用いて画像化した。 HMVECsは、陽性対照として使用した。 3月5日フィールドの代表が示された。バー：100μmである。 <img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 細胞数依存的に図2。U87細胞誘導管。として隅に示されているU87細胞の異なる番号が管腔形成のために使用された。 HMVECsは陽性対照のために使用された。バー：100 mmです。

<ol><li>Shao, R., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microvascular+endothelial+cells+immortalized+with+human+telomerase+catalytic+protein%3A+a+model+for+the+study+of+in+vitro+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+%26+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Human microvascular endothelial cells immortalized with human telomerase catalytic protein: a model for the study of in vitro angiogenesis.</a> Biochemical & Biophysical Research Communications. 321, 788-794 (2004).</li>
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<li>Seftor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+interactions+of+laminin+5+gamma2+chain%2C+matrix+metalloproteinase-2%2C+and+membrane+type-1-matrix%2Fmetalloproteinase+are+required+for+mimicry+of+embryonic+vasculogenesis+by+aggressive+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cooperative interactions of laminin 5 gamma2 chain, matrix metalloproteinase-2, and membrane type-1-matrix/metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggressive melanoma.</a> Cancer Research. 61, 6322-6327 (2001).</li>
<li>Shirakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry+and+pseudo-comedo+formation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry and pseudo-comedo formation in breast cancer.</a> International Journal of Cancer. 99, 821-828 (2002).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

成功するために、このアッセイのためには、マトリゲルの品質は、最初にテストする必要があります。小さなサンプルがHMVECsを使用してアッセイを事前に実行するためのバイオサイエンスBDから得ることができる。別のバッチの製品には、いくつかの多くは管腔形成のための最適な条件を提供しないような異なる資質を表示することがあります。マトリゲルのアリコートを96ウェルプレートにロードされたときに気泡が細管形成を混乱させることができるので、第二に、あらゆる気泡が、避けるべきである。小さな気泡が十分に書かれていた場合に、マトリゲルは、すぐに実験中に氷上で保存する元マトリゲル管に戻すことができます。さらに、テストされた細胞は対数増殖期での成長率で維持されるべきである。細胞の低成長を示す任意の培養条件が発生した場合、それらは健康な細胞に置き換える必要があります。減少温度（室温）はチューブの形成に影響を与える可能性があるため、管が固定されていない場合最後に、顕微鏡下で管の解析は1時間を超えるべきではない。全アッセイは、細胞死が誘導された管状構造の混乱を避けるために、24時間以内に終了してください。それは、チューブ形成が細胞移動、細胞間接着、生存、およびアポトーシ...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11995 </td></tr><tr><td> FBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td>成長因子を減らしたマトリゲル</td><td>バイオサイエンスBD </td><td> 47743-720 </td></tr><tr><td> EBM2キット</td><td>ロンザ</td><td> CC - 3156 </td></tr><tr><td>ニコンECLIPSEのTS100顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td></tr></tbody></table>

腫瘍細胞のvasculogenic活性を評価するためにマトリゲルベースの​​チューブ形成アッセイ

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

過去数十年にわたって、チューブ形成アッセイを使用して成長因子を減らしたマトリゲルは通常、 体外 1-5 の血管内皮細胞の血管形成活性を実証するために採用されています。しかし、最近成長している証拠は、このアッセイは、内皮細胞の血管の動作をテストするために限定されないことが示されている。その代わりに、それはまた、血管の表現型6-8を開発するために腫瘍細胞の数の能力をテストするために使用されています。この機能により、異種移植動物、vasculogenic擬態（VM）9と呼ばれるプロセスで特定された彼らのvasculogenic行動と一致していた。その腫瘍細胞媒介性のVMを証明する証拠の多くがある内皮細胞の血管新生6、10-13の独立した腫瘍の発生に重要な役割を、果たしている。例えば、腫瘍細胞は、悪性黒色腫と神経膠芽腫患者の8、10、11から組織サンプルにおける血液灌流、血管チャネルの形成に関与することが見出された。ここで、我々は、腫瘍細胞のvasculogenic活性の評価に有用なツールとして、この筒状のネットワークのアッセイを説明した。我々はそのようなメラノーマB16F1細胞、神経膠芽腫U87細胞、および乳癌MDA - MB - 435細胞のようないくつかの腫瘍細胞株は、血管の細管を形成することができることを発見、しかし、一部には、結腸癌HCT116細胞などしないでください。さらに、この血管の表現型は、マトリゲル上に播種した細胞数に依存しています。したがって、このアッセイは、血管細胞、腫瘍細胞だけでなく、他の細胞を含む種々の細胞型の血管性をスクリーニングするための強力なユーティリティとして機能することができる。

チューブ形成アッセイは、腫瘍細胞の血管活性を評価するために使用されます。

腫瘍細胞のVasculogenic活性を評価するためにマトリゲルベースの​​チューブ形成アッセイ

過去数十年にわたり、成長因子低減Matrigelを用いた管腔形成アッセイが、血管新生能を実証するために一般的に用いられてきました。

本実験の総合的な目的は、さまざまな腫瘍細胞種のin vitroにおける管形成を測定し、in vivoでの血管活性を評価することです。これは、腫瘍細胞をMatrigelに添加して管形成を誘導することで達成されます。第2段階として。Matrigel上の細胞を37°Cで一晩インキュベートし、管腔形成を促します。次に、各細胞株によって形成された管腔を画像化します。各細胞株で形成された管腔の平均数を定量化し、異種移植腫瘍モデルに基づいた、これらの細胞のin vivoにおける血管形成能を評価します。この手法は、in vitroでの血管活性の測定方法など、がん研究分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。腫瘍細胞を調製するため、まずUAD sevenメラノーマ、B 16 F1 MDA、MB 4 35、または結腸HCT one 16細胞を、10% FBSおよびペニシリンを添加したDMEMで培養します。ヒト微小血管内皮細胞（H EC）は、1 µg/mLのヒドロコルチゾン、1 ng/mLの表皮成長因子、10% FBS、およびペニシリンを添加したEBM two培地で培養します。PBSで細胞を洗浄し、0.05% trypsin EDTAで剥離させ、2000 rpmで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。その後、再びPBSで洗浄します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測し、温めたMatrigelを調製します。成長因子低減Matrigel 1 mLを室温に戻します。その後、直ちに氷上に10分間置きます。96ウェルプレートの各ウェルに50 µLずつピペットで分注します。プレートを37 °Cで30分間インキュベートします。1～2 × 10⁵個の腫瘍細胞または血管内皮細胞を、それぞれDMEMまたはeBM2で再懸濁し、マトリジェルの上部に播種します。試薬が管腔形成に及ぼす影響を調べる場合は、無血清培地に試薬を添加し、37 °Cで一晩インキュベートします。画像解析のために、10%ホルマリン生理食塩水溶液10 µLを添加し、10分間静置します。次に、位相差顕微鏡を用い、10倍対物レンズで観察します。各ウェルにつき、ランダムに選んだ3〜5視野の小管数をカウントし、その平均値を算出します。HMCsは、これらの管状構造が、互いに連結して多角形ネットワークを形成する明瞭に伸長した細胞体から発達したため、陽性対照として使用されました。B 16 F1 U 87およびMDA MB 4 35細胞は、H ecsによって形成されたものと同様の血管管状構造を発達させましたが、HCT one 16細胞では認められませんでした。U 87細胞を用いて、細胞投与量依存的な管腔形成能を試験した。本図に示すように、細胞数を2倍に増やすと、10,000個の細胞では不連続な管腔が形成された。一方、H ecsで観察されたも

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