球状担持脂質二重層アッセイ:ミクロスフェア上のセプチンアセンブリを観察する技術

セプチンは、湾曲した原形質膜表面に結合する重要な細胞骨格タンパク質です。

ミクロスフェア上のセプチン集合をin vitroで観察するには、まず、二重層形成の固体支持体として機能する、均一なサイズの微細なシリカビーズの懸濁液を取ります。この懸濁液をボルテックスして、ビーズクラスターを破壊します。

小さな単層小胞、SUV - 単一の脂質二重層に囲まれた球形小胞でそれを補います。一定の攪拌でインキュベートし、マイクロスフェアの沈降を防ぎます。

インキュベーション中、外側の極性ヘッドグループは、親水性マイクロスフェア表面へのSUVの吸着を促進します。この相互作用によりSUVが破裂し、続いてSUV脂質が連続層として湾曲した微小球表面に融合し、球状の支持脂質二重層(SLB)が形成されます。

洗浄して余分な結合していない脂質を除去し、反応バッファーに再懸濁します。非特異的吸着を防ぐために、球状のSLB懸濁液をポリエチレングリコールでコーティングされた表面の小さな領域に移します。蛍光標識セプチン懸濁液をチャンバーに加え、インキュベートします。

セプチンは、球状SLBの正の曲率を認識するヘテロオリゴマーを形成し、重合してフィラメントを形成します。最終的に、セプチンフィラメントは互いに相互作用し、高次構造の形成につながります。

セプチンでコーティングされたSLBを高分解能蛍光顕微鏡で観察します。蛍光の存在は、セプチンの曲率感受性沈着を示します。

まず、シリカ微小球の入ったボトルを15秒間渦巻きます。次に、1分間バス超音波処理し、再び15秒間ボルテックスしてクラスターを破壊します。ビーズをSLBBおよび10マイクロリットルの5ミリモルSUVと低接着性の微量遠心チューブで混合します。

ビーズと脂質の混合物を室温で1時間インキュベートし、沈降を防ぐためにシェーカーでインキュベートします。その間に、PEG化カバーガラスを解凍し、カットした0.2ミリリットルのPCRチューブを接着します。インキュベーション後、指定されたRCFでビーズを30秒間遠心分離します。

最初のスピンの後、50マイクロリットルの上清を取り除きます。次に、200マイクロリットルのPRBを加え、激しいピペッティングで混合します。次のラウンドでは、200マイクロリットルのPRBを除去し、2回目と3回目のスピンの後にさらに200マイクロリットルを追加し、4回目のスピンの後に220マイクロリットルのPRBを追加します。

複数のビーズサイズで競合アッセイを行う場合は、各ビーズサイズを等量混合し、このビーズ混合物の29マイクロリットルを721マイクロリットルの反応バッファーで希釈することによって反応を調製します。次に、75マイクロリットルの希釈ビーズとSSBで希釈したタンパク質25マイクロリットルをウェルに加え、混合します。

定

常状態でセプチンを測定する場合は、混合物を室温で1時間インキュベートしてから、TIRF近傍または共焦点顕微鏡で画像化します。