細胞外蛍光グルコースアナログ枯渇の測定:マウス臓器におけるグルコース取り込みをex vivoで評価するための代理測定技術

組織では、細胞外グルコースは、特定のグルコーストランスポーターを介した促進拡散を介して細胞に侵入します。

グルコースは、代謝経路である解糖を介して細胞質内でピルビン酸に分解され、細胞代謝プロセスのためにアデノシン三リン酸(ATP)の形でエネルギーを生成します。

ex

vivoでグルコース取り込みを測定するには、採取したばかりの小型マウス肝組織から始めます。生理学的状態を維持するために適切なバッファーを追加します。

次に、組織をグルコースフリー培地を含むマルチウェルプレートに移します。その後、蛍光標識グルコース類似体であるデオキシグルコースを添加したグルコースフリー培地でインキュベートします。組織のサイズが小さいため、デオキシグルコースの侵入が可能になります。

デオキシグルコースは、グルコースがない場合、グルコーストランスポーターを介して細胞に入ります。細胞内では、デオキシグルコースはリン酸化を受けますが、それ以上代謝されず、蓄積につながります。

未利用の蛍光標識デオキシグルコースを含む培地を目的の時点で収集します。マイクロプレートリーダーを使用して、細胞外デオキシグルコースの蛍光を測定し、これはデオキシグルコースの細胞内組織取り込みと相関することができます。

採取した組織または臓器をPBSを含む6ウェルプレートで1分間インキュベートします。各組織または臓器を別々のウェルで処理します。1分後、各ティッシュを滅菌ペーパータオルの上に置き、PBSを吸収します。

4,000マイクロリットルの無グルコースDMEMを含む別の6ウェルプレートに組織または臓器を移し、2分間インキュベートします。2分後、組織を取り出し、0.29ミリモルのFD-グルコース作業溶液を含む6ウェルプレートのウェルに移します。組織を含む6ウェルプレートを摂氏37度のFD-グルコース作業溶液中でインキュベートします。

0、10、20、30、40、60、90、および120分のインキュベーション後に、各ウェルから100マイクロリットルのFD-グルコース作業溶液を収集し、収集した100マイクロリットルのFD-グルコース作業溶液を96ウェルプレートに移して、細胞外FD-グルコース枯渇の動態を分析します。収集の前後に振ってください。

マイクロプレートリーダーを使用して、それぞれ485ナノメートルと535ナノメートルの励起波長と発光波長での蛍光を測定します。