リガンドアッセイの差動放射状毛細管作用:細菌ヌクレオチドセカンドメッセンジャー結合細胞内タンパク質を同定するためのハイスループット技術

細菌は、適切な刺激に応答してヌクレオチドセカンドメッセンジャー、NSM(細胞内シグナル伝達分子)を生成します。これらの分子は標的タンパク質に結合し、細菌の機能を調節します。

リガンドアッセイの示差放射状毛細管作用を使用してこれらの標的タンパク質を同定するには、可溶性タンパク質を含む細菌細胞溶解物を含むマルチウェルプレートを取ります。これらのタンパク質は、ゲノム内の個々のORF(オープンリーディングフレーム)を発現するさまざまな細菌クローンに由来し、各ウェルが異なるタンパク質を持っていることを保証します。

放射性リンで標識されたNSMであるグアノシン四リン酸塩と五リン酸塩の混合物を追加します。これらの分子は、ライセート中の標的タンパク質に結合します。ピンツールを使用して、各ウェルから同量の液体を収集します。ツールをニトロセルロース膜の上に置き、液体をスポットとして堆積させます。

標的タンパク質は、非共有結合相互作用を介して膜に結合し、その拡散を防ぎます。これにより、結合した放射性標識NSMが適用の中心点に隔離されます。遊離NSMは毛細管現象により液相とともに放射状に拡散する

蛍光体イメージングを使用して放射性信号を検出し、スポットのデジタル画像を取得します。2 つの円を使用してスポットを定義します。外側のものは、拡散したNSMの周辺を示しています。内側の円は、隔離された NSM を表します。

結合率 - 拡散スポットの総放射能に対する内側の円から検出された放射能の強度を計算します。結合画分が高いスポットを特定して、NSM結合標的タンパク質を含むウェルを同定します。

標的タンパク質のDRaCALAスクリーニングでは、解凍した全細胞ライセートを96ウェルV底マイクロタイタープレートの個々のウェルに20マイクロリットルを加え、各ウェルに2.5単位のセラチアマルセセンスエンドヌクレアーゼを加えます。摂氏37度で15分後、ライセートを氷の上に20分間置きます。

次に、等量のリン32標識五リン酸と四リン酸グアノシンを混合し、混合物に1x溶解バッファー#1を加えて、4ナノモルのグアノシン五リン酸溶液を得る。

マルチチャンネルピペットとろ過されたピペットチップを使用して、10マイクロリットルのグアノシン五リン酸混合物を細胞ライセートと混合し、室温で5分間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、96Xピンツールを0.01%非イオン性界面活性剤の溶液で30秒間3回洗浄し、その後、洗浄ごとにペーパータオルで30秒間乾燥させてから、ピンツールを96ウェルサンプルプレートに入れます。30秒後、ピンツールをまっすぐ持ち上げ、ニトロセルロースメンブレンの上に30秒間まっすぐ下に置きます。

5分間の乾燥後、示されているように、ニトロセルロース膜を透明なプラスチックフォルダーに入れて、蛍光体スクリーンを露光し、蛍光体イメージングによる視覚化を行います。

蛍光体イメージャーに関連付けられた分析ソフトウェアで潜在的な標的タンパク質を定量および同定するには、視覚化されたプレートの.gelファイルを開きます。

解析するスポットを定義するには、「配列解析」機能を使用して、12列×8行のグリッドを設定します。スポット全体の外縁を外接するには、大きな円を定義します。定義された大きな円の「ボリューム+背景」と「面積」をスプレッドシートにエクスポートして、小さな内側のドットを外接します。定義した円のサイズを小さくします。

定義した小さな円の「ボリューム+背景」と「面積」をエクスポートし、すべてのデータをスプレッドシートに保存します。必要に応じて、円をスポットと重ねるように配置し、実際のスポットより少し大きくサイズ変更します。

式を使用して、スプレッドシート内の結合率を計算し、データをプロットします。次に、他のウェルの大部分と比較して高い結合画分を示すウェル内の潜在的な結合タンパク質を特定します。