Bioreporter Assay:生物発光レポーターシステムを用いたSARS-CoV-2抗体検出のための高感度技術

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) 感染中、ウイルス スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン RBD が宿主細胞のアンジオテンシン変換酵素 2 である ACE2 に結合し、ウイルス細胞の侵入を促進します。それに応えて、免疫系はウイルスRBDに結合して細胞への侵入を防ぎ、ウイルスの感染性を低下させる抗体を産生します。

RBDを標的とするSARS-CoV-2抗体を検出するには、SARS-CoV-2スパイクRBDに融合した小さなサイズのタンパク質フラグメントを含む組換えバイオレポーター懸濁液を使用します。標準的なRBD標的SARS-CoV-2抗体と抗体結合磁気ビーズを追加します。

インキュベーション中、Fc抗体領域はビーズのFc結合ドメインに結合します。さらに、組換えバイオレポーターは、ビーズ結合RBDを標的とするSARS-CoV-2抗体に結合します。

インキュベーション後、混合物を遠心分離します。結合していないバイオレポーター含有上清を除去します。結合したビーズをバッファーに再懸濁します。マルチウェルプレートに移します。

小さなサイズのタンパク質フラグメントに対して高い親和性を持つ、大きなサイズのタンパク質フラグメントを含む溶液を追加します。大小のタンパク質断片が結合し、活性な改変ルシフェラーゼ酵素を形成します。

ルシフェラーゼ基質であるフリマジンを加える。ルシフェラーゼはフリマジンの酸化を触媒し、発光を引き起こします。ルミノメーターを使用して、中和抗体の存在を示す発光を測定します。

シグナル強度が高いということは、RBDを標的とするSARS-CoV-2抗体が高濃度であることを示唆しています。

HiBiT-RBD抗体検出アッセイを実行するには、HiBiT-RBDバイオレポーターを調製し、50マイクロリットルのHiBiT-RBD含有上清と1マイクログラムの市販のSARS-CoV-2-RBD抗体を1.5ミリリットルのマイクロチューブで混合します。

20マイクロリットルの免疫グロブリン結合タンパク質、またはプロテインGを溶液に加えます。PBSを加えることで、総量を300マイクロリットルにします。チューブをチューブシェーカーまたはローテーターで30分間インキュベートし、12,000 x g で30秒間遠心分離した後、上清を廃棄し、PBSで洗浄します。このプロセスを3回繰り返して、遊離したHiBiT-RBDを除去します。

細胞を50マイクロリットルのPBSに再懸濁し、96ウェルプレートに移します。50マイクロリットルの1x LgBiTを加え、5分間待ちます。次に、50マイクロリットルの1x NanoLuc基質を加えます。すぐにルミノメーターで発光信号を読み取ります。