In Vitro Single Oocyte Reporter Assay:In vitro卵子成熟中の標的mRNA翻訳調節を研究する技術

減数分裂の前期Iの卵母細胞は転写活性です。それらはmRNAを産生し、休眠状態で保存します。成熟中、卵母細胞が中期に入ると、貯蔵されたmRNAはタンパク質に翻訳されます。

mRNAの翻訳を研究するには、一滴の培地に懸濁した前期I停止マウス卵母細胞から始めます。保持ピペットを単一の卵母細胞の近くに配置して、所定の位置に保持します。

レポーターミックスを含むマイクロインジェクションピペットを取ります。このミックスには、黄色蛍光タンパク質(YFP)(標的遺伝子の3'非翻訳領域と融合したレポーター)をコードする1つの異なるタイプのmRNAと、赤色蛍光タンパク質をコードするポリアデニル化mRNAの2種類が含まれています。

レポーターミックスを卵母細胞に注入します。マイクロインジェクションされた卵母細胞を、プロフェーズI停止を維持する化学阻害剤であるシロスタミドを添加した成熟培地でインキュベートします。

卵母細胞は、赤色蛍光強度がプラトーに達するまでポリアデニル化mRNAを翻訳しますが、ポリアデニル化テールを欠くYFPをコードするmRNAのレベルはそのまま残ります。

処理した卵母細胞をシロスタミドを含まない成熟培地に移し、減数分裂を再開するのを助けます。そして標的mRNAは翻訳を受けて、黄色の蛍光レポーターと融合した標的タンパク質を産生します。

タイムラプスイメージングを実行して、一定の間隔で蛍光シグナルを視覚化します。

注入された卵母細胞は一定レベルの赤色蛍光を示しますが、黄色の蛍光は時間の経過とともに増加し、レポータータンパク質の翻訳と段階的な蓄積を示しています。

まず、26ゲージの針で卵胞壁に小さな切り込みを入れて、洞状卵胞を慎重に開きます。口で操作するガラスピペットを使用して、卵丘細胞のいくつかの層で無傷のCOCを分離します。小型のピペットを使用し、ピペッティングを繰り返すことでCOCを機械的に除去します。

剥がれた卵母細胞を吸引し、1マイクロモルのシロスタミドを添加した成熟培地を入れたペトリ皿に入れます。皿をインキュベーターに2時間入れて、卵母細胞を卵胞からの隔離によって引き起こされるストレスから回復させます。

長さ10センチのホウケイ酸ガラス毛細管と機械式プーラーを配置して注射針を準備します。最適な注入のために、加熱されたフィラメントを使用して針先を45度の角度で曲げます。塩基性卵母細胞採取培地の20マイクロリットルの液滴をポリスチレン皿に入れ、液滴を軽い鉱物油で覆います。

Ypet、UTRおよびmCherryをそれぞれ1マイクロリットルあたり12.5マイクログラム添加することにより、より大量のレポーターミックスを調製します。これらのアリコートを摂氏マイナス80度で保管します。解凍したら、アリコートを20,000 x gで2分間遠心分離します。次に、新しい微量