JoVE 実験百科事典
生物学的技法
0 回視聴 • 7:16 分 • July 8th, 2025
減数分裂の前期Iの卵母細胞は転写活性です。それらはmRNAを産生し、休眠状態で保存します。成熟中、卵母細胞が中期に入ると、貯蔵されたmRNAはタンパク質に翻訳されます。
mRNAの翻訳を研究するには、一滴の培地に懸濁した前期I停止マウス卵母細胞から始めます。保持ピペットを単一の卵母細胞の近くに配置して、所定の位置に保持します。
レポーターミックスを含むマイクロインジェクションピペットを取ります。このミックスには、黄色蛍光タンパク質(YFP)(標的遺伝子の3'非翻訳領域と融合したレポーター)をコードする1つの異なるタイプのmRNAと、赤色蛍光タンパク質をコードするポリアデニル化mRNAの2種類が含まれています。
レポーターミックスを卵母細胞に注入します。マイクロインジェクションされた卵母細胞を、プロフェーズI停止を維持する化学阻害剤であるシロスタミドを添加した成熟培地でインキュベートします。
卵母細胞は、赤色蛍光強度がプラトーに達するまでポリアデニル化mRNAを翻訳しますが、ポリアデニル化テールを欠くYFPをコードするmRNAのレベルはそのまま残ります。
処理した卵母細胞をシロスタミドを含まない成熟培地に移し、減数分裂を再開するのを助けます。そして標的mRNAは翻訳を受けて、黄色の蛍光レポーターと融合した標的タンパク質を産生します。
タイムラプスイメージングを実行して、一定の間隔で蛍光シグナルを視覚化します。
注入された卵母細胞は一定レベルの赤色蛍光を示しますが、黄色の蛍光は時間の経過とともに増加し、レポータータンパク質の翻訳と段階的な蓄積を示しています。
まず、26ゲージの針で卵胞壁に小さな切り込みを入れて、洞状卵胞を慎重に開きます。口で操作するガラスピペットを使用して、卵丘細胞のいくつかの層で無傷のCOCを分離します。小型のピペットを使用し、ピペッティングを繰り返すことでCOCを機械的に除去します。
剥がれた卵母細胞を吸引し、1マイクロモルのシロスタミドを添加した成熟培地を入れたペトリ皿に入れます。皿をインキュベーターに2時間入れて、卵母細胞を卵胞からの隔離によって引き起こされるストレスから回復させます。
長さ10センチのホウケイ酸ガラス毛細管と機械式プーラーを配置して注射針を準備します。最適な注入のために、加熱されたフィラメントを使用して針先を45度の角度で曲げます。塩基性卵母細胞採取培地の20マイクロリットルの液滴をポリスチレン皿に入れ、液滴を軽い鉱物油で覆います。
Ypet、UTRおよびmCherryをそれぞれ1マイクロリットルあたり12.5マイクログラム添加することにより、より大量のレポーターミックスを調製します。これらのアリコートを摂氏マイナス80度で保管します。解凍したら、アリコートを20,000 x gで2分間遠心分離します。次に、新しい微量遠心チューブに移します。
注射針に約0.5マイクロリットルのレポーターミックスをロードします。保持ピペットと注射針をホルダーに入れ、卵母細胞採取培地の液滴に配置します。
注射針を保持ピペットに軽くたたいて開きます。卵母細胞を塩基性収集培地の液滴に入れ、レポーターミックスを5〜10ピコリットル注入します。卵母細胞を1マイクロモルのシロスタミドを含む成熟培地で16時間インキュベートし、mCherryシグナルがプラトーになるようにします。
タイムラプス顕微鏡検査の場合は、注入されたレポーターごとに2つの20マイクロリットルの成熟培地液滴を含むペトリ皿を準備します。対照前期 I 停止卵母細胞用の 1 マイクロモル シロスタミドを含む 1 滴と、成熟卵母細胞用のシロスタミドを含まない 1 滴。液滴を軽い鉱物油で覆い、インキュベーターに入れます。
プレインキュベーション後、注入された卵母細胞をインキュベーターから取り出し、シロスタミドを含まない成熟培地で4回洗浄します。いくつかの卵母細胞を、前期I卵母細胞対照群として1マイクロモルのシロスタミドを含む成熟培地に保持します。
注入された卵母細胞を、事前に準備したタイムラプス顕微鏡皿上のそれぞれの液滴に移します。卵母細胞を閉じたガラスピペットでクラスター化して、記録中の卵母細胞の動きを防ぎます。
テキスト原稿に記載されているパラメータを使用して、発光ダイオード照明システムを備えた顕微鏡と、摂氏37度、二酸化炭素5%に維持された環境チャンバーを備えた電動ステージの下に皿を置きます。
タイムラプス実験の適切な設定を入力して、[アプリ]、[多次元取得] の順にクリックします。最初のタブ「メイン」を選択し、「タイムラプス」「複数のステージ位置」「複数の波長」を選択します。
「保存中」タブを選択して、実験を保存する場所を入力します。次に、「タイムラプス」タブを選択して、時点の数、期間、および時間間隔を入力します。「ステージ」タブを選択します。明視野をオンにし、新しいウィンドウを開き、「取得」、「取得」、「ライブ表示」を選択して、卵母細胞の位置を見つけます。
卵母細胞が特定されたら、「多次元取得ウィンドウ」に戻り、「+」を押して卵母細胞の位置を設定します。「波長」タブを選択し、明視野、YFP、mCherryの3つの異なる波長を設定します。YpetとmCherryの露出を調整します。次に、「取得」をクリックしてタイムラプス実験を開始します。
Ypet-3' UTR翻訳の分析には、卵母細胞ごとに2つの領域測定を実行します。「楕円領域」をクリップして卵母細胞自体を、「長方形領域」をクリックして背景の減算に使用する卵母細胞を囲む小さな領域をクリップします。「ログを開く」をクリックし、「ログデータ」をクリックして、領域測定データをスプレッドシートにエクスポートします。
個々の卵母細胞およびすべての測定時点について、YFP波長とmCherry波長の卵母細胞領域測定値からバックグラウンド領域測定値を個別に差し引きます。