細胞透過性ペプチドとメンブレンとの相互作用を研究するための蛍光リークアッセイ

細胞浸透性ペプチドであるCPPは、短く正に帯電したペプチドであり、細胞膜と相互作用して細胞膜を通過することができ、細胞不透過性貨物の送達を促進します。

細胞膜模倣物を使用して試験CPPの膜透過性の可能性をin vitroで研究するには、大きな単層小胞LUV懸濁液から始めます。

LUVは、膜不透過性蛍光プローブと対応するクエンチャーペアをロードしたリン脂質二重層で構成されています。小胞内では、消光剤は近接しているため蛍光プローブと相互作用し、蛍光消光を引き起こします。

LUV懸濁液を石英蛍光キュベットにピペットで入れ、バッファーを使用して希釈します。磁気バーを追加します。実行中のLUV沈降を防ぐために、磁気撹拌を備えた分光蛍光計に移します。バックグラウンド蛍光を測定して、LUVリークを排除します。

所

望の濃度のCPPを定期的にLUV懸濁液に加えます。

CPPのアミノ酸残基の疎水性と電荷に基づいて、それらはLUV脂質膜を乱し、膜の浸透と透過処理を引き起こします。

小胞膜の損傷により、蛍光プローブとクエンチャーが周囲の溶液に漏れ、空間的分離が増加します。その結果、プローブは蛍光を示します。

さらに

CPP溶液を添加すると、LUVの透過処理と蛍光強度が増加します。CPP添加による蛍光強度の増加は、ペプチドの膜透過性の可能性を示唆しています。

蛍光漏れを測定するには、石英蛍光キュベット中の 1 ミリリットルの HEPES バッファー 2 で LUV を 100 マイクロモルの最終濃度に希釈し、実験中の溶液の均質化を促進するために磁気スターラーを追加します。

最初の100秒間はLUVを単独で測定してバックグラウンド蛍光を評価し、その後900秒間にペプチド溶液のアリコートを添加した際の蛍光強度の増加としてリークを測定します。

ポジティブコントロールとして100%蛍光リークを測定するには、1マイクロリットルのTriton X-100をLUVに加えて小胞を可溶化し、分析の最後の100秒間にプローブを完全に消します。次に、式を使用して各時点での漏れ率を計算します。