化学共役抗体-抗原コンジュゲートを検証するための酵素結合免疫吸着アッセイ

免疫応答を誘発するために、抗原は、抗原の取り込みを助ける樹状細胞、またはDC(抗原提示細胞)の表面に存在するエンドサイトーシス受容体に特異的な抗体に結合します。

抗体-抗原複合体の形成は重要なステップであり、抗原を DC 標的モノクローナル抗体に化学的に結合させることで in vitro で達成できます。

結合プロセスの効率を検証するには、捕捉された抗体でプレコートされたELISAプレートから始めます。プレートをブロッキング溶液で処理して、抗原がコーティングされた表面に非特異的に結合するのを防ぎます。

化学的に架橋された抗体抗原複合体をプレートに加え、インキュベートします。抗原の特異的エピトープは、捕捉された抗体のパラトープと相互作用し、抗体-抗原-抗体複合体を形成します。

次に、酵素に結合した3番目の抗体セットをプレートに重ねます。これらの抗体は、複合体中に存在する一次抗体に特異的に結合し、その検出を可能にします。

発

色基質を含むバッファーを追加して、コンジュゲートを視覚化します。抗体に結合した酵素が基質と反応し、着色された生成物を生成します。

プレートを酸性化不活化溶液で処理すると、酵素が不活性化され、反応が終了します。プレートを分光光度法で分析します。着色された溶液の存在は、抗体抗原複合体の存在を検証し、結合の成功を確認します。

ELISAによる結合の成功を検証するには、適切な96ウェルELISAプレートをウェルあたり100マイクロリットルの抗OVA抗体でコーティングし、ブロッキングバッファーで抗DEC-205/OVAを1:2の比率で連続希釈して、6マイクログラム/ミリリットルから93.8ナノグラム/ミリリットルまでの希釈液を得る。

各希釈液100マイクロリットルを抗体でコーティングされたプレートの適切なウェルに加え、室温で1時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、抗DEC-205 / OVA複合体に対する100マイクロリットルの西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗体をプレートに加え、室温で1時間インキュベートします。

次に、50マイクロリットルの西洋わさびペルオキシダーゼ基質を各ウェルに加え、分光光度法による色反応の分析を可能にします。