特徴付ける草食動物の耐性機構：上Spittlebugs Brachiaria属。例として

こんにちは、私は国際熱帯農業センターの昆虫学者、Ush Baraです。本ビデオの全体的な目的は、共通の取り組みである、スピットバグ（ツノゼミ類）への耐性を向上させるための育種計画を支援するため、ホスト植物の害虫に対する抵抗性メカニズムを特性解析する方法を実演することです。ここでは、イネ科植物を例に説明します。

ツバキムシ（Spit bugs）は、熱帯地域の牧草、サトウキビ、トウモロコシなど、経済的に重要な多くのイネ科植物にとって深刻な害虫です。アメリカ熱帯地域の牧草地では、gen属の細菌を含む牧草が最も重要な寄主となっています。植物は、主に3つのメカニズムを通じて草食動物による食害に抵抗します。

アンティビオーシス（抗生物質作用）、不耐性、あるいは「非嗜好性」とも呼ばれる現象は、植食性昆虫が植物を選択できる場合に、その植物が避けられる程度のことを指します。アンティビオーシスは通常、植食性昆虫に複数の遺伝子型へのアクセスを与えて選択させる試験によって検出されます。アンティビオーシスは、植物がそれを摂食する植食性昆虫の適応度に影響を及ぼす程度のことです。

最後に、耐性は、HBOの成長や繁殖を損なうことなく、植物がHBOによって引き起こされる損傷に耐え、あるいはそれを修復できる程度のことです。抗生物質能と耐性は、HBOを限定的な環境に閉じ込め、単一の植物のみを摂食させる「選択肢のない試験（no choice test）」で最も正確に検出できます。本ビデオでは、抗生物質への不耐性を推定するために設計された、シタバカメムシ（spit bug）IVの選択肢のない試験について実演します。アリアグラス類において、ホスト植物の抵抗性は、シタバカメムシ管理の重要な戦略となります。

しかしながら、強力な抗菌物質に基づく抵抗性は、より病原性の高い害虫バイオタイプへの選択圧を生じさせる可能性があります。一方で、耐性に基づく抵抗性では、個体数が植物を圧倒するまでスピットドッグ（spit dog）の個体群が増え続けることになります。したがって、持続的な抵抗性を実現するには、抗菌物質と耐性の両方をあるレベルで兼ね備える必要があると考えられます。

このプロトコルでは、唾液虫（spit bug）耐性に対する各因子の相対的な寄与度を推定する方法を実演します。Aria Ariaの遺伝子型は、国際熱帯農業センター（International Center for Tropical Agriculture）の生殖質バンクから調達したものです。植物体は、実験単位として使用される成熟株から単一の茎切り挿しによって栄養繁殖させます。

植栽材料の均一性を確保し、植物病原体による汚染を防ぐため、挿し木を10 centimetersに切り揃えます。挿し木を3%次亜塩素酸ナトリウム溶液で2分間洗浄し、その後、水道水で十分にすすぎます。各挿し木を、PVCチューブ内の約36 gramsの滅菌土壌に植え、チューブの下部は発泡スチロールカップの下部で封止し、上部はPVCブッシングでキャップします。

挿し木は、ブッシングの中央の開口部に配置されたフォームリングで固定します。植物には肥料を与え、十分な土壌水分を維持するために灌水が必要です。昆虫による負荷試験を行う前に、植物を1か月間育成し、根食性昆虫の摂食部位となる表層根を発達させます。

害虫を放つ8日前から植物を倒置させておくことで、表在根の成長がさらに促進され、根の構造に固有の個体差を部分的に調整することができます。この工程には人工光源が必要であり、本手法では1日24時間照射します。表在根がほとんどない、あるいは全くない植物。

この反転処理の後、これらの個体は実験から除外されます。定植から30日後、各植物の土壌表面に、飼育コロニーから得られた成熟卵6個を接種します。これらのコロニーを確立するために、野外から採集し種を同定した成虫のツバキラアブラムシ（spittle bugs）を飼育ケージに入れ、餌として感受性のあるariaの葉を与えます。雌は、ケージの底に設置した浅い取り出し用トレイ内の土壌に産卵します。

数日後、土壌を水に懸濁させ、一連のふるいに通して卵を回収します。懸濁した材料を30%塩水溶液に浸すと、成熟した卵が浮上し、未成熟な卵は残存する有機物に付着して取り除かれます。昆虫病原体による汚染を防ぐため、卵を0.5%次亜塩素酸ナトリウム溶液で5分間消毒し、その後、蒸留水で洗浄します。寄生実験には、孵化直前の成熟した卵のみを選別して使用します。

昆虫の眼に相当する前方に2つの赤い点があることで識別できます。後方には昆虫の腹部に相当するピンク色の印があり、permが完全に展開しています。孵化の成否は4日後に確認し、孵化しなかった卵は新生のspit blockに置き換えます。

コロニー試験の結果です。植物は6反復の乱塊法で配置されています。実験は、接種から約30日後に評価されます。

植物の被害度をスコアリングすることで、耐性を推定できます。一方で、昆虫の生存率をスコアリングすることで、抗生物質の影響を推定できます。被害度は1から5の視覚的スケールを用いてスコアリングし、1を可視的な被害なし、5を植物の枯死とします。

次に、最終的な齢に達したか、あるいは成虫になった昆虫の数を数えることで生存率を評価します。抵抗性メカニズムを分類するには、x軸に昆虫の生存率、y軸に植物の被害量をプロットしたグラフを用いて結果を可視化することが有用です。グラフ上で右から左へ移動するにつれて、抗バイアス性が高まります。

一方で、上から下へ移動するにつれて耐性は増加します。植食性動物に対する反応がこのプロットの下半分に位置する場合、その植物は抵抗性を持つと考えられます。この反応が左側の四分圏に位置する場合、主要な抵抗メカニズムは抗生物質によるものです。

応答が右側の象限に位置する場合、支配的な耐性機構は耐容性（tolerance）です。以下は、我々のスクリーニングデータの代表的なサンプルです。上部の点は、感受性植物を示しています。

左下の象限にある点は、抗生物質によって耐性を持つ植物を示しています。右下の象限にある点は、耐忍性によって耐性を持つ植物を示しています。これで、植物の抵抗性に対する抗生物質と耐忍性の相対的な寄与度を推定するための、ノチョイスアッセイ（no choice assay）のデモンストレーションをご覧いただきました。

ここではAriaにおけるspit bug耐性を例に挙げましたが、提示した原理は他の系にも適用可能です。このビデオが皆様のご研究の一助となれば幸いです。ご健闘をお祈りします。