ウイルスゲノムを定量するためのドットブロットアッセイ

ドットブロットアッセイを使用してウイルスDNAを定量するには、単離されたウイルスDNA懸濁液から始めます。アルカリ性溶液で処理して、二本鎖DNAを一本鎖に変性させ、その後のハイブリダイゼーションを行います。

ドットブロット装置を事前に濡らしたナイロンメンブレンで組み立てます。変性ウイルスDNAと線形化した標準プラスミドDNA溶液をウェルにロードします。適切な真空を適用し、静電相互作用を通じて正に帯電した膜表面への効果的な負電荷を帯びたウイルス一本鎖DNAの転移と結合を促進し、ドットパターンを形成します。

実行後、メンブレンをクエン酸ナトリウムバッファーで洗浄し、アッセイ感度の向上に役立ちます。乾燥後、膜を紫外線にさらし、ブロットされたDNAを膜に架橋します。

熱変性した非異種DNAフラグメントとウイルスゲノム特異的放射性リン標識DNAプローブ懸濁液をハイブリダイゼーションバッファーに添加します。インキュベートし、ハイブリダイゼーションを促進します。

DNA断片はブロッキング剤として作用し、残りの膜領域に結合し、非特異的プローブ結合を最小限に抑えます。放射性プローブは、ウイルスの一本鎖DNA上の相補配列とハイブリダイズします。

洗浄バッファーで洗浄し、ハイブリマイズされていないプローブを除去します。蛍光体画像スキャンシステムを使用して、膜上のウイルスゲノムにハイブリダイズされた放射性プローブから放出される放射性信号を定量し、ドットブロット信号を取得します。

標準曲線から、メンブレン上の各ドットのシグナル強度を使用して、サンプル中のウイルスDNAの量を計算できます。

ドットブロットアッセイを実行するには、AAVベクターゲノムプラスミドDNAを水またはTris-HClバッファーで1マイクロリットルあたり10ナノグラムに希釈して、プラスミドDNA標準を調製します。希釈したプラスミドDNAの25マイクロリットルのアリコートを新鮮なチューブに移し、50マイクロリットルの反応量で適切な制限酵素で1時間線形化します。

消化したプラスミドDNA標準試料の入ったチューブに450マイクロリットルの水またはTEを加え、完全に混合します。次に、この混合物の70マイクロリットルを、1,330マイクロリットルの水またはTEを含む新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、希釈したプラスミド標準品を作ります。

ドットブロット装置をセットアップするには、はさみを使用して、ブロッティングメンブレンをサンプル数と標準品の数に適したサイズにカットします。膜を水に10分間浸してから、ドットブロット装置に置きます。次に、未使用の井戸を覆います。サンプルがロードされる井戸に水を追加します。真空を適用し、井戸に水を通し、エラーがないか確認してから、ネジを締め直します。必要に応じて再テストします。

釈した各プラスミドDNA標準液を400マイクロリットルを各ウェルに適用し、標準希釈液を4レーン実行します。標準ダイジェストの2つの別々のアリコートを使用し、それぞれを2回ロードします。次に、各ウイルスDNAサンプルのウェルあたり200マイクロリットルを塗布します。穏やかな真空を適用して、ウェルを通してDNA溶液をプールします。次に、すべての井戸が空になったら、三方弁を調整して真空を解放します。

各ウェルに400マイクロリットルの1Xアルカリ溶液を加えます。次に、5分間待ってから、真空を再適用してウェルを空にします。真空を再度適用し、ドットブロット装置を分解します。次に、メンブレンを取り外し、2X SSCですすいでください。

DNA結合面を上に向けて、メンブレンを清潔なペーパータオルの上に置き、余分なバッファーを除去します。適切なUV架橋剤を使用して、ブロットされたDNAをメンブレンにUV架橋します。これで、膜はハイブリダイゼーションの準備が整いました。

DNA結合面を上にして、膜をハイブリダイゼーションボトルに入れます。5〜10ミリリットルの予熱したハイブリダイゼーションバッファーでメンブレンをすすぎ、バッファーを廃棄します。次に、10ミリリットルの予熱したハイブリダイゼーションバッファーを加え、摂氏65度に設定された回転ハイブリダイゼーションオーブンにボトルを入れます。ボトルを少なくとも5分間回転させます。

性精子DNAと放射性プローブをボトル内のハイブリダイゼーションバッファーにすばやく加え、10秒間振って混合します。ボトルを摂氏65度のオーブンに戻し、摂氏65度で少なくとも4時間回転させながらインキュベートします。

ハイブリダイゼーションが完了したら、回転を停止し、ハイブリダイゼーションボトルを取り外し、漏れ防止プラグシールキャップ付きの50ミリリットルの円錐形チューブに放射性プローブ溶液を注ぎます。メンブレンを洗浄するには、20〜30マイクロリットルの予熱した洗浄バッファーをハイブリダイゼーションボトルに加え、5分間回転させます。この洗浄をさらに2回繰り返します。

3回目の洗浄後、ハイブリダイゼーションボトルから膜を取り除き、ペーパータオルで膜から余分な緩衝液を取り除きます。次に、メンブレンを透明なプラスチック製の紙ホルダーに入れます。ガイガーカウンターを使用して、膜の放射性信号を確認します。

[トリリング]

消去した蛍光体イメージングスクリーンを膜に露出させた後、蛍光体イメージスキャンシステムを使用してスクリーンをスキャンし、各ドットの信号強度に関するデータを取得します。