タンパク質発現レベルを推定するための定量的ウェスタンブロッティング

定量的ウェスタンブロッティング(全タンパク質正規化ベースの手法)は、標的タンパク質の発現レベルの定量に役立ちます。

まず、組織ライセートをポリアクリルアミド勾配ゲルのウェルにロードします。ライセートには、他の細胞タンパク質とともに標的タンパク質が含まれています。

ゲルを適切な電圧で実行し、グラジエントに沿ってサンプルタンパク質を電気泳動分離します。完了したら、転写スタックのポリマー膜の上にゲルを置きます。

電流を流して、分離されたタンパク質を膜に移します。次に、メンブレンを蛍光トータルプロテイン染色に入れます。染色中の荷電した色素分子は、膜上のすべてのタンパク質に静電的に結合します。

ブロックソリューションを追加します。したがって、溶液中のタンパク質は膜に結合します。検出試薬の非特異的結合を防ぎます。標的タンパク質にのみ結合する一次抗体を追加します。次に、一次抗体に結合する二次抗体(蛍光色素で標識)を追加します。

レーザーでサンプルを励起します。全タンパク質染色の色素分子と抗体結合蛍光色素から放出された蛍光を、対応する波長で記録します。

正規化されたタンパク質負荷値を計算するには、各レーンの総タンパク質シグナルを最高値で割ります。標的タンパク質シグナルを対応する正規化された負荷値で除算して、標的タンパク質の相対的な発現を決定します。

電気泳動の場合は、ゲル電気泳動チャンバーシステムにプレキャストされた4〜12%Bis-Trisグラジエントゲルをセットアップし、3.5マイクロリットルのタンパク質標準をウェルにロードします。メンブレン間の正規化に内部標準を使用する場合は、他のサンプルと等しい量をタンパク質ラダーの隣の最初の3つのウェルにロードし、残りのウェルに各サンプル30マイクログラムをロードします。次に、サンプルをスタッキングゲルに80ボルトで10分間通し、続いて150ボルトでさらに45〜60分間流します。

電気泳動の最後に、転写スタックを組み立てるために、ポリ二フッ化ビニリデン膜を含む下部スタックにタンパク質ゲルを置き、続いてろ紙を置きます。吸い取りローラーを使用して気泡を取り除き、上部のスタックをろ紙の上に置き、スタックを再度転がして気泡を取り除きます。

デバイスの左側にある電極を使用してスタック全体を転送デバイスに移し、ゲルスポンジをスタックの上に置き、スポンジがデバイス上の対応する電気接点に揃うようにします。

ふたを閉めたら、適切なプログラムを選択して起動します。プログラムの最後に、メンブレンをゲルサイズにカットし、カットしたメンブレンを二重蒸留水ですばやく洗浄してから、トータルプロテイン染色を続行します。

全タンパク質染色の場合は、タンパク質側を内側に向けてメンブレンを50ミリリットルのチューブに転がし、ローラー上の5ミリリットルのタンパク質染色液でメンブレンをヒュームフードで室温で5分間標識します。

インキュベーションの最後に、5ミリリットルの洗浄液でメンブレンをすばやく洗浄し、洗浄の合間にチューブをローラーに短時間戻し、続いて超純水で短時間すすいでください。メンブレンに3ミリメートルのブロッキングバッファーを加え、室温で30分間、メンブレンをローラーに戻します。ブロッキングバッファーを適切な最適化濃度の目的の一次抗体に置き換え、ローラー上でメンブレンを摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、室温でローラーで洗浄ごとに5ミリリットルの新鮮なPBSでメンブレンを5分間6回洗浄します。最後の洗浄後、ローラー上の適切な二次抗体溶液とともにメンブレンを室温で1時間インキュベートし、その後、洗浄ごとに30分間3回洗浄します。最後の洗浄後、メンブレンを乾燥させ、アルミホイルを使用してメンブレンを光から保護します。

画像取得の場合は、タンパク質側を下に向けてメンブレンをスキャナーに置き、ソフトウェアでスキャン領域を選択します。次に、両方のチャネルで画像を取得し、その画像を適切な画像解析プログラムにエクスポートします。

700ナノメートルのチャンネルを表示してタンパク質染色の総結果を表示し、「分析」を選択して長方形を描画して、正規化の対象領域を定義します。次に、最初の長方形の領域をコピーして個々のサンプルに貼り付け、定義された領域が分析されたすべてのレーンで同じサイズになるようにします。

各レーンのタンパク質濃度を定量するには、総タンパク質染色と目的のタンパク質の両方の結果をスプレッドシートプログラムにコピーし、最高の総タンパク質染色シグナルを決定します。次に、各総タンパク質染色シグナル値をこの値で割って正規化されたタンパク質負荷値を取得し、個々のサンプルからの800ナノメートルのシグナル値を対応する正規化されたタンパク質値で割って、異なるサンプルにおける相対的なタンパク質発現比を計算します。