Name: 発達研究のためのウィンドウ鶏卵 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: 学ぶウィンドウ鶏卵の準備法。胚の生存時間を延ばし、ビーズ配置や染料注入、in ovo探索などの神経生物学実験を可能にする最適化されたプロトコルを紹介します。

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1。インキュベーターから卵を取り除く<ol><li> 37維持° C 60％以上に設定された相対湿度と。 </li><li>卵を取り外し、卵を90 °回転、大きな基盤が水平に横たわるように。 </li></ol> 2。綿棒は、卵消毒に<ol><li> 70％エタノールで非滅菌ガーゼのスタックを飽和させる。 </li><li> 5卵にまで綿棒に2〜3個を使用してください。ガーゼが汚れた場合は破棄する。 </li></ol> 3。卵白除去サイトの準備<ol><li>ちょうどアルブミンを引き抜くされる領域を保護するためにベースの左側3Mプラスチックテープの1&quot;× 1&quot;の部分をカットして置きます。 </li></ol> 4。卵白の除去<ol><li>テープの真ん中に小さな穴を作るためにハサミのポイントを使用してください。 </li><li> 18ゲージ、1インチの針を10 ccシリンジを使用して、ゆっくりとハサミで作った穴から針をドリル。 </li><li>卵の底に向かって45 ° Cの角度で針を駆動します。 </li><li>中心に向かって針を傾け、卵白の3〜4 mLを策定する。 </li></ol> 5。ウィンドウイング<ol><li>ビニールテープの3&quot;x 3&quot;の部分をカットし、卵の上に収まるようにそれを伸ばす。あまりにも強く引っ張らないように注意しながら、卵の水平表面の丸い端を角のコーナーを拡張。それはない折り目と卵の表面にしっかりとなるようにテープを引っ張る。 </li><li>シャープストレート4&quot;解剖ハサミを使って、テープが配置された領域の下部中央に穴をねじる。ゆっくりの内側に対してヒントを保つようにしている卵にはさみの下刃をガイドシェルは。ベースに向かってブレードを直接ゆっくりとシェルをカットし始めます。ちょうど上部中央に達する前に停止し、反時計回りに進む。はさみを削除するとのほんの少しになるまで反対の方向に進んで繰り返す卵は、接続されたままになります。卵子が受精されることを確かめてください。ウィンドウをシャットダウンします。 </li></ol> 6。卵を再度開き、シール、閉会。 <ol><li>広いビニールテープ&quot;1 / 2に長い&quot;約2〜3カットし、カットした穴に戻って収まるようにウィンドウをシャットダウンします。テープの別の1 × 1&quot;の部分を取ると卵子が排出された穴を塞ぐ。どんな操作を行うために卵を再開する鉗子のペアを使用してください。あなたがインキュベーターに卵を返すように準備ができたら、一部をカットウィンドウを密封し、卵の全体の水平方向の表面をカバーするために十分な大きさのテープの。 </li></ol>

<ol><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).</li>
<li>Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).</li>
<li>Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).</li>
<li>Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).</li>
<li>Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).</li>
</ol>

このメソッドは、実験操作後の長期生存時間が可能になります。例えば、色素標識研究は、後に運命のマッピングの研究（1）E10またはに生存を許さ。さらに、それは後の発達段階（2-6）に進むために遺伝子の発現レベルと必要な開発の変化を提供するOVOエレクトロポレーション研究のために使用されています。このウィンドウテクニックは、胚への操作後の生存を必要とするすべての手順と組み合わせて使用​​することができます。

<table><tbody><tr><td>回転インキュベーター</td><td> </td><td>Profi</td><td></td><td>温度37&amp;deg;、相対湿度60%以上に維持</td></tr><tr><td>70 % EtOH</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>3Mプラスチックテープ</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>10ccシリンジ</td><td> </td><td></td><td></td><td>卵1個につき1本</td></tr><tr><td>18G針</td><td> </td><td></td><td></td><td>1&amp;#189; インチ針、シリンジ1本につき1本</td></tr><tr><td>解剖用はさみ</td><td> </td><td></td><td></td><td>4&quot; 直刃、鋭利なもの</td></tr><tr><td>受精卵</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr></tbody></table>

発達研究のためのウィンドウ鶏卵

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

開発の研究が大幅に実験モデルとしてニワトリ胚の使用によって促進されています。胚のアクセシビリティの容易さは、ニワトリウズラのキメラとフォーカル色素のラベリングを含めて、いくつかのアプローチを、使用して細胞の運命をマッピングするための実験を​​可能にした。さらに、それはタンパク質でコーティングされたビーズとOVOエレクトロで使用してプラスミドDNAの導入の配置などのいくつかの種類の分子摂動、することができます。これらの実験は、中枢および末梢神経系の発達に重要なデータが得られている。これらの研究の多くの場合、それは卵の殻を開いて、胚の成長を乱すことなく、それをrecloseする必要があります。胚は、卵殻を再度開くことにより、連続した発達段階で調べることができます。鶏の卵を開くためのいくつかの優れた方法がありますが、この記事では、長い生存期間のために最適化されている一つの方法を示しています。この方法では、卵はその側にかかっていると、小さなウィンドウがシェルにカットされます。実験手順の後に、シェルはその開発期間中の卵をカバーするために使用されます。卵殻を覆う透明なプラスチックテープは、胚を保護し、潜伏期間の残りの中に水和を保持するのに役立ちます。このメソッドは、インキュベーションの2日間の始まりを使用されており、成熟した胚古くから生存を可能にした。

胚のアクセシビリティの容易さは、ニワトリウズラのキメラとフォーカル色素のラベリングを含めて、いくつかのアプローチを、使用して細胞の運命をマッピングするための実験を​​可能にした。この記事では、長い生存時間に対して最適化されている1個の卵の調製方法を示しています。

発生学の研究は、実験モデルとしてのニワトリ胚の利用によって大いに促進されてきました。胚へのアプローチが容易であることから...

Kramer Labへようこそ。私はカリフォルニア大学アーバイン校神経生物学・行動科学科のMatt Kornです。本日は、ビーズの配置、色素の注入、またはin ovo探索など、さまざまな操作に向けた鶏卵の調製方法をご紹介します。それでは、早速始めていきましょう。まず、卵を洗浄します。理由は、インキュベーター内に付着している可能性のある不純物が多いためです。これをテープで密封します。卵を採取するウィンドウ部分に小さな破片が入り込み、取り出したい時までに胚が死亡する確率が高まるのを防ぐためです。インキュベーター内では、卵の太い側を上に向けた状態で置かれていることがわかると思います。次に、卵を横に傾けます。これにより、2つのことが可能になります。1つは、観察窓がこちら側に来ること、そして2つ目は、胚が上部に浮上するため、あらゆる操作が行えるようになることです。ここで、インキュベーターに入れていたラックから、いくつかの卵を段ボール製の卵ホルダーに移します。これは実際には卵が配送されてきたときに入っている容器です。今日は、単に卵を保持するためにこれを使用します。配置の方法はあなた次第です。私は、いつでもすべての卵にアクセスでき、かつ卵同士が触れ合わないようにこの方法で配置することを好みます。万が一、緩んでいてひびが入っている卵を見つけ、それを落としてしまったとしても、それぞれに適度な間隔が空いているため安心です。それでは、ガーゼを用意し、このように適度な厚みの束を取り出して2つに分けます。ここに70% alcoholを注ぎ、底まで十分に湿るまで浸します。このガーゼの束全体を使って、すべての卵を拭き取ります。そこで、まず上部を数か所処理し、上部を重点的に行いますが、実質的に卵全体を囲むようにします。これが終わると、アルコールはかなり早く乾くため、テープを貼ることができます。テープはしっかりと密着し、通常、一連の処理を終える頃には最初の一つの乾燥が完了しているため、卵の準備の次のステップに進むことができます。それでは、それをゴミ箱に戻します。これで次のステップに進む準備ができました。さて、すべての卵をアルコールで拭き取ったので、卵の大きい側、つまり卵の底に排水穴を開けます。これにより、アルブミンを抽出することが可能になります。アルブミンを抽出しないと、胚が適切に配置されないためです。操作を行うことはできません。したがって、ここではブレードを使用して、このプラスチックテープを取り除くだけとなります。これはわずかに弾性があり、非常に都合が良いです。穴が想定より少し大きくてもカバーできるだけでなく、実際に卵全体を覆う際には、これを伸ばす必要があるからです。そのため、ウィンドウとなる領域を完全に覆います。では、このように切り取り、約1mmの幅のストリップを作成します。そして、ここから1 mm四方ほどのテープを作成します。次に、このテープを日付のすぐ左上に配置します。そこに置けば、このように見えます。非常によく貼り付いています。次に、あらかじめ作成しておいたテープに戻り、さらに1 mmのテープを切り取ります。そして同様に、卵の最上部にあたる番号の左側に配置します。横向きにしたので、右側にあります。そして、ここにもう一点あります。手を洗っておりますので、現在は手袋を着用していません。手袋を着用していると、このテープが手袋に張り付いてしまうためです。現時点では、活性物質への他の物質の混入については特に懸念していません。そこで、先端の尖ったハサミを用意します。テープを貼った位置の中心にハサミを入れ、わずかに破れるまで反時計回りに回します。そこに小さな穴が開いているのがわかります。シリンジを挿入すれば十分な大きさに広がるため、穴を大きく開ける必要はありません。最初から針で直接刺して卵を割ろうとすると、卵の側面全体が割れてしまうことが多いため、このようにしています。これで卵はもう使えません。それでは、卵を排出します。側面に小さな穴が開いているので、10 mLのシリンジとかなり太いゲージの針を使用して、アルブミンを抽出します。ここで、約3～4 mLの液を加えたいと思います。確実に3 mL以上、ただし4.5～5 mLを超えないようにしてください。これにより、上部に位置している胚が殻から少し離れ、操作が可能になります。45度の角度で刺入することで、卵黄の下に入ります。次に、卵黄の下に潜り込ませるために少し右に回します。針先が卵の底に触れる感覚がわかるはずです。そのまま約3～4 µLを抽出します。これでスムーズに回収できました。このアルブミンを廃棄バケツに入れ、他の卵の作業を続けます。それでは、先に進めましょう。ここで、排出用に開けた穴が想定より少し大きくなっていますが、問題ありません。注意したいのは、針を刺す際にさらにひびが入らないようにすることです。それでは進めていきます。さて、卵にすでにわずかなひびが入っているのが見えます。小さなひび割れであれば問題ありませんが、卵の別の面にまで及んでいる場合は注意が必要です。今回のケースでは、穴からわかるように、ひび割れが広がっています。ほぼ上まで達しています。実際、ここにウィンドウが配置されることになります。そのため、残念ながらこの卵は破棄しなければなりません。また、廃棄に特別な手順はありません。特定のプロトコルを作成する必要などはなく、そのまま廃棄バケツに入れてください。これらの黒いゴミ箱は動物廃棄物として区別するために使用していますが、それ以外の手順はすでに完了しています。次の卵に進みましょう。それでは、すべての卵の排水が終わりましたので、排水穴に蓋をします。これは非常に重要です。なぜなら、インキュベーター内での処置を怠ると、残っているアルブミンが激しく蒸発してしまうからです。卵が乾燥するということは、その卵が死ぬことを意味します。そのため、同程度の大きさのテープを穴の上に貼り、再びこの穴を操作する必要がないようにします。場合によっては、卵を開封した後にさらに多くのアルブミンを抽出したいと考えた際、この穴が密閉領域のような役割を果たすため、ここに針を刺してもアルブミンが大量に流出することはありません。それでは、卵を十分な大きさのテープで覆います。これは、風船に小さなピンを刺す前に、一部にテープを貼るのと似ていると思います。面白いのは、そうすることで風船が破裂しないということであり、今回の場合、卵に少量のテープを貼ることに相当します。これにより、卵が多点でひび割れるのを防ぎ、その後ウィンドウを密封できます。ウィンドウを閉じた際、テープを使用しているため、良好なシールが形成され、蒸発を心配する必要がなくなります。テープのサイズがわかりますが、おそらくこれまでで最大のものになります。それでも、少し伸ばして、軽く引っ張るようにしてテンションをかけながら、卵の上に配置します。そして、後ろ側に回り込み、ウィンドウを設ける部分にシワが寄らないよう、非常に慎重に卵の上で伸ばします。テープの位置は少し調整可能です。それほど強く張り付くわけではないので、心配する必要はありません。一度張り付いてしまえば、そのまま固定されます。こちらのあたりが、ウィンドウを切り抜く予定の範囲になります。さて、すべての卵にテープを貼ったので、上部に窓を開けていきます。この工程が最も難しく、多くの場合、ここで大多数の卵を失うことになります。そのため、まずはアルコールを浸したガーゼでハサミを十分に拭き、その後、乾燥させます。アルコールはほぼ自然に乾燥しますが、アルコールが直接卵の中に入ることは避けなければなりません。そのため、テープが貼られている中心部分に刃を入れ、再び時計回り、反時計回りに動かし、わずかにひびが入る音がするまで繰り返します。それで、刃が中に入ったことがわかります。次に、ハサミを外側に動かし、卵の表面とほぼ平行にします。そして、ハサミの刃が完全に入るまで、小さく切り込みを入れます。半円状に切り進めた後、反対方向から戻ります。卵を開けるための窓を作りたいので、完全に円を描かないようにしてください。これで卵を開けることができます。現時点では、予想していた通りの週数に見えます。血管はあまり多くありませんが、胚が位置している周辺に少量の血液が見られます。主に心拍が始まり、血液が流れ出した心臓領域からのものです。ですので、そのままそっと閉じ、上に乗せた状態で保持し、再度戻ってきてウィンドウを閉じます。そして、同様に表面に沿って平らにし、反対方向に動かします。さて、ここにいくつかの気泡があり、胚が端に寄っていることがわかります。ここで、2つの対処法があります。卵が十分にあり、すべてを使い切る必要がない場合は、これをそのまま廃棄して構いません。あるいは、ウィンドウを閉じて、胚が再び目的の最上部まで浮上するように設定することもできます。操作を行うタイミングで、胚が目的の位置にある可能性があります。もしそうでなければ、その時点で廃棄します。ここでは、単に角度をつけて置いています。アルブミンが少し流れ出しますが、それによって胚が必要な位置に戻るのを助けます。さて、このようにウィンドウをすべて作成したので、操作を行う前にそれらが確実に閉じていることを確認する必要があります。そして、卵を再び密封します。ただし、開口部がある場合、ときどき卵黄が流れ出してしまうことがあります。部屋から部屋へ移動する際に卵が少し傾いただけで、中身がすべて流れ出てしまうことは避けたいからです。したがって、プラスチックテープを、幅1mm、長さはおよそ2〜3mmのサイズに切り取ります。それを中央あたりに配置し、卵の前で下に引っ張ることで、しっかりと固定させます。窓が、別のテープがあったちょうどその場所にフィットしているのがわかります。窓を切り抜いたことで、現時点ではかなり密閉された状態になっています。この後すぐにいくつか操作を行うため、完全に気密である必要はありません。以上が、卵の準備と窓作成の手順です。それでは、実験の成功をお祈りしております。

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