強力なTCRシグナルに対する胸腺細胞応答を調節するキナーゼ阻害剤の同定

マウス胸腺細胞をマルチウェルプレートに収めて開始します。抗CD3抗体および抗CD28抗体でコーティングされた磁気ビーズを追加します。ウェルのサブセットに、適切な濃度の試験キナーゼ阻害剤を追加します。インキュベート。

抗体は、二重陽性胸腺細胞の細胞表面CD3およびCD28受容体に結合して活性化し、T細胞受容体、TCRのダウンレギュレーション、およびサイトゾルプロテインキナーゼの活性化を引き起こします。

これらのプロテインキナーゼは下流のシグナル伝達経路を活性化し、細胞表面のCD69発現と細胞質ゾルカスパーゼ-3の活性化を増加させます。活性化されたカスパーゼ-3は必須の細胞タンパク質を切断し、胸腺細胞のアポトーシスを開始します。

キナーゼ阻害剤で処理された細胞では、阻害剤はサイトゾルキナーゼをブロックし、CD69発現とカスパーゼ-3活性化を調節します。

胸腺細胞のTCR、CD4、CD8共受容体、およびCD69受容体に結合する蛍光色素タグ付き抗体カクテルでピペットを採取します。胸腺細胞を緩衝液で処理して固定し、透過性化します。

細胞質ゾルカスパーゼ-3に結合する蛍光色素タグ付き抗カスパーゼ-3抗体とインキュベートします。フローサイトメトリーを使用して胸腺細胞を分析します。

対照二重陽性胸腺細胞は、蛍光細胞表面マーカーCD4、CD8、CD69および細胞内カスパーゼ-3を発現し、TCRダウンレギュレーションを示します。対照的に、阻害剤で処理された胸腺細胞は、より低いレベルの蛍光CD69およびカスパーゼ-3を示します。

キナーゼ阻害剤による胸腺細胞の治療を開始するには、マルチチャンネルピペットを使用して、胸腺細胞のウェルあたり40マイクロリットルを少量のプレートに加えます。皿を氷の上に置きます。次に、キナーゼ阻害剤、DMSO、およびデキサメタゾンの1部と、完全なRPMI培地の4部を96ウェルプレートにピペットで入れます。

希釈したデキサメタゾンを5マイクロモル濃度で添加することにより、小容量プレートの8ウェルを未処理のコントロールに指定し、4ウェルを細胞死のデキサメタゾン処理ポジティブコントロールに指定し、希釈したDMSOを0.5マイクロリットル添加することにより、ビヒクル処理されたコントロールに4ウェルを指定します。次に、阻害剤プレートの対応するウェルから、希釈した各阻害剤を0.5マイクロリットルを96ウェルプレートに加えます。

胸腺細胞の刺激を開始するには、まず、抗CD3およびCD28ビーズが均一に再懸濁されていることを確認します。次に、1ミリリットルのビーズを2ミリリットルのPBSバッファーで洗浄します。チューブを磁気スタンドに置き、ビーズを上清から分離し、溶液を吸引します。次に、ビーズを1ミリリットルの完全なRPMI培地に再懸濁します。

あたり10マイクロリットルのビーズ懸濁液を、阻害剤処理された各サンプル、DMSO処理された4つのサンプル、および8つの未処理サンプルのうち4つに加えます。残りの4つの未処理ウェルに10マイクロリットルの完全なRPMIを追加します。

マイクロプレートオービタルシェーカーを使用して、プレートを穏やかに撹拌します。次に、胸腺細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%の環境で17〜20時間または一晩インキュベートします。

自動層流プレート洗浄機に、最初に150ミリリットルのエタノール-トゥイーン溶液をプライムし、次に1%トゥイーン-20を添加した脱イオン水、最後にFACS洗浄バッファーをプライムします。インキュベーションの最後に、プレートウォッシャーシステムを使用して、9回の洗浄サイクルを使用してFACS洗浄バッファーでプレートを洗浄します。各洗浄により、層流によって 55 マイクロリットルの洗浄バッファーが添加および除去され、その結果、ウェル内の試薬が指数関数的に希釈されます。

表面抗原を染色するには、まず、1単位容量の抗CD3、抗CD4、抗CD8、および抗CD69抗体を100単位容量のFACS洗浄バッファーで希釈します。次に、細胞を25マイクロリットルの染色抗体混合物に再懸濁します。マイクロプレートオービタルシェーカーを使用してプレートを穏やかに攪拌し、プレートを氷の上に30分間放置します。

細胞を固定するには、まず、前述のように9回の洗浄サイクルを使用して、55マイクロリットルのFACS洗浄バッファーでプレートを洗浄します。次に、50マイクロリットルの固定および透過処理バッファーを各ウェルに加えます。よく混ぜ、プレートを氷上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、提供された10倍ストックの25ミリリットルを225ミリリットルの超純水で希釈することにより、1倍パーマ/洗浄バッファーを調製します。

プレートウォッシャーを1xバッファーでプライミングし、前述のように9回の洗浄サイクルを使用して、55マイクロリットルの1xバッファーでプレートを洗浄します。1ミリリットルの抗カスパーゼ-3抗体と2ミリリットルの1xパーマおよび洗浄バッファーを混合します。ウェルあたり25マイクロリットルの混合物を固定セルに加えます。

マイクロプレートオービタルシェーカーを使用して、プレートを穏やかに撹拌します。プレートを氷の上に1時間置きます。インキュベーションの最後に、洗浄ステップを1倍パーマと洗浄バッファーで9回繰り返します。次に、25マイクロリットルのFACS洗浄バッファーをプレートのすべてのウェルに加え、数回上下にピペットで溶液を混合します。

最後に、混合サンプルをマイクロタイターチューブに移します。チューブにFACS洗浄バッファーを総容量200マイクロリットルまで補充し、フローサイトメトリー分析に進みます。