結腸組織切片の免疫組織化学的分析による化学物質誘発性大腸炎の評価

マウスでは、結腸粘膜層は固有層を含む免疫細胞で構成され、粘膜を保護する密に詰まった上皮に囲まれています。デキストラン硫酸ナトリウムによる化学処理は、タイトジャンクションを破壊し、上皮細胞の損傷を引き起こし、管腔微生物が固有層に浸透できるようにします。

結腸内の微生物の認識はケモカイン分泌を引き起こし、免疫細胞の浸潤と炎症誘発性サイトカインの放出につながります。この誇張された免疫反応は、結腸の炎症や大腸炎を引き起こします。

化学誘発性大腸炎を評価するには、化学誘発性大腸炎を示す固定された前処理されたマウス結腸組織切片を運ぶスライドガラスから始めます。それぞれの免疫細胞に結合する免疫細胞の受容体に特異的な一次抗体のカクテルで切片を処理します。

結合していない抗体を洗浄して除去します。一次抗体に特異的に結合するビオチン化二次抗体とともに組織切片をインキュベートします。ビオチンと相互作用して複合体を形成するストレプトアビジン-酵素複合体とインキュベートします。

組織切片を発色基質で重ねます。酵素と基質の相互作用により、免疫細胞に茶色の着色が与えられます。ヘマトキシリン色素で切片を対比染色し、細胞核を染色します。

染色されたスライドを顕微鏡で観察します。損傷した領域に褐色の免疫細胞が豊富にあることは、化学物質誘発性大腸炎を示しています。

免疫組織化学分析では、ホットプレート上で切片を20分間温めた後、スライドをPBSで1回10分間洗浄1回3回洗浄し、10分間の3%過酸化水素インキュベーションで内因性ペルオキシダーゼを除去します。

インキュベーションの最後に、示されているようにサンプルをPBSで3回洗浄し、室温で少なくとも1時間、ブロッキングバッファーで非特異的結合をブロックします。次に、ブロッキングバッファーを目的の一次抗体カクテルに交換し、摂氏4度で一晩インキュベーションします。

翌朝、余分な一次抗体溶液を吸引し、スライドをPBSで3回洗浄します。最後の洗浄後、スライドを適切なビオチン化二次抗体カクテルでインキュベートし、続いて室温でストレプトアビジン西洋わさびペルオキシダーゼ複合体で標識します。

免疫反応性細胞を視覚化するには、明るい茶色または暗褐色になるまでサンプルをDABで標識し、ヘマトキシリンと0.3%希釈アンモニアで切片を対比染色します。

スライドが乾燥したら、光学顕微鏡を使用して組織切片の明視野画像を10倍の倍率で取得し、画像処理プログラムを使用して、上皮と固有層の両方でマークされた免疫細胞の集団を同定および定量します。