二相性分離によるヒト血液由来好中球からの脂質の単離

細胞内成分を放出した好中球ホモジネートを含むガラス管を取ります。

脂質-脂質および脂質-タンパク質相互作用を破壊する極性溶媒であるメタノールを追加します。メタノールの固有の極性は、極性脂質を均一に分散させ、可溶化します。次に、非極性脂質と相互作用して分散・可溶化させる非極性有機溶媒であるクロロホルムを加える。

遠

心分離機でタンパク質含有ペレットを脂質、多糖類、細胞破片を含む上清から分離します。上清を新しいガラス管に移します。クロロホルムと蒸留水を加えます。サンプルを遠心分離します。

水の添加は自発的に二相性システムを形成し、生体分子を下部クロロホルム層と上部の水メタノール層内に分配します。

クロロホルム層は溶解した非極性脂質で構成され、上層には非脂質汚染物質とより極性の脂質が含まれています。脂質含有層を乱すことなく、上部の水-メタノール層を除去します。

真空濃縮器を使用して脂質から溶媒を除去します。さらに使用するまで低温で保管してください。

ヒト末梢血由来の好中球から脂質を分離するには、調製した好中球を取り、氷の上に置きます。好中球をPTFEシール付きの15ミリリットルスクリューキャップガラス管にピペットで移し、1分間振とうして均質化します。次に、2ミリリットルのメタノールを加え、1分後に1ミリリットルのクロロホルムを加えます。さらに1分間振った後、ガラス管を室温で50RPMで30分間回転させます。

次に、溶液を摂氏7度、1952倍gで10分間遠心分離することにより、タンパク質画分をペレット化します。上清を新しい15ミリリットルのガラス製スクリューキャップチューブに慎重にデカントし、タンパク質含有ペレットを残します。将来の定量のために、ペレットを摂氏マイナス20度で保管します。

1ミリリットルのクロロホルムを加え、1分間待ちます。次に、1ミリリットルの二重蒸留水を加え、ガラススクリューキャップチューブをサンプルで30秒間反転させます。以前と同様にサンプルを遠心分離した後、上相を濁った層まで除去して廃棄しますが、曇った層は含めません。サンプルを摂氏60度の真空濃縮器で乾燥させ、必要になるまで摂氏マイナス20度で保管します。