免疫不全マウスにおける生体工学ヒト微小血管ネットワーク

この手順の全体的な目的は、生体内でヒトの血管ネットワークを構築することです。これは、まずヒト血液由来の内皮コロニー形成細胞およびヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を培養することで達成されます。次に、これら両方の細胞種をコラーゲンベースのゲルに混合し、免疫不全マウスの皮下に注入します。

7日後、インプラントを回収し、ヒト血管ネットワークの形成を評価します。最終的に、インプラント内部にヒト特異的な微小血管が存在することは、組織学的検査および免疫組織化学的染色によって確認できます。構築物を外科的に移植する従来の方法と比較して、本技術の主な利点は、簡便に実施でき、手術を必要としない点にあります。

まず、E CFCsのバイアル1本を融解し、直ちに10 mLのDMEMを含む15 mLコニカルチューブ内で細胞を希釈します。細胞懸濁液を1200 RPMで5分間遠心分離し、細胞ペレットを10 mLの温めたEGM-2培地で再懸濁します。その後、細胞を1%ゼラチンでコートした100 mm組織培養プレートに移し、加湿インキュベーターで一晩培養します。

翌朝、培地と未結合の細胞を穏やかに吸引して除去します。次に、結合した細胞に新鮮なE GM two培地 10 millilitersを添加します。コンフルエントな単層が形成されるまで、今後数日間にわたりこの操作を繰り返します。

次に、細胞を10 millilitersのPBSで洗浄します。PBSを2 millilitersのtrypsin EDTAに置き換え、プレートをインキュベーターに戻して5分間静置します。5分後、顕微鏡下でプレートを軽く叩き、細胞が剥離しているかを確認します。

そうでない場合は、緩やかに揺らしながら短いインキュベーションを繰り返します。細胞が完全に剥離したら、8 mLのEGM-2培地を細胞に添加し、15 mLのコニカルチューブに回収します。細胞数を計測し、1200 RPMで5分間遠心分離します。

次に、1%ゼラチンでコーティングした組織培養プレートに、播種密度5,000 cells/cm²で細胞を播種します。EGM two medium中で細胞をインキュベートし、2〜3日ごとにEGM two mediumで培地交換を行います。継代4回目から8回目までの以降の継代においても、この手順を繰り返します。

E CFCsが使用可能な状態になります。このプロトコルはMSCsの培養にも適用可能です。E GM two mediumをM-S-C-G-M mediumに置き換えてください。

コーティングされていない培養プレートを使用します。コンフルエンスが80%に達した時点で継代を開始し、播種密度10,000 cells/cm²で継代します。本実験では、インプラント1個あたり800,000 E CFCsおよび1,200,000 MSCsが必要です。

通常、5つのインプラントを同時に調製します。まず、培養プレートから細胞培地を吸引し、各細胞プレートを10 mLのPBSで洗浄します。PBSを2 mLのtrypsin EDTAに置き換え、プレートを緩やかに揺らしながらインキュベートします。

すべての細胞が剥離するまで、2〜5分ごとに顕微鏡下で細胞を確認します。その後、8 mLのDMEMを加え、細胞懸濁液を回収します。15 mLコニカルチューブを用いて細胞数をカウントし、5つのインプラント分に相当する細胞量を別の15 mLコニカルチューブに転送します。

次に、細胞を1200 RPMで5分間遠心分離し、上清を除去します。フィブリノゲンとコラーゲンフィブロネクチンの混合液を氷上で慎重に調製します。その後、氷冷した混合液を用いて、細胞ペレットを非常に穏やかに再懸濁します。

気泡が混入しないように注意しながら、細胞懸濁液を1 mLシリンジに充填し、キャップ付きの26G針を装着します。細胞混合液を注入するまで、充填したシリンジを氷上で保持してください。イソフルランチャンバーを用いて、6週齢のアチミックヌード免疫不全マウス4匹を麻酔しました。

マウスに麻酔をかけ、足指への刺激に反応しなくなったことを確認した後、各マウスへの注射を行います。30ゲージの針を用い、50 µLのトロンビン溶液を背面上部に皮下注射します。同じ部位に、200 µLの細胞混合液を注射します。

26ゲージの針を使用して注入された高分子はゲル化し、皮膚の下に小さいながらも認識可能な隆起を形成します。注入後、マウスを快適さと保温のためにガーゼの上に置いてください。マウスが歩行できるようになるまで観察します。

その後3日間、動物の全身状態を毎日観察します。注射から1週間後、二酸化炭素でマウスを安楽死させ、外科的にゲルプラグを摘出します。回収後、定規と一緒にゲルプラグを撮影し、各ゲルプラグを組織用カセットに入れ、10%中性緩衝ホルマリンに浸して室温で一晩保存します。

翌日、10%中性緩衝ホルミンを蒸留水で洗い流します。組織学的評価を行うまで、カセットをPBSに入れ4°Cで保存します。パラフィンに包埋したインプラントを7 µmの厚さに切片作成します。

次に、インプラント中央部における微小血管の密度を定量化します。H&E染色を用いて、1平方ミリメートルあたりの血管数を算出し、微小血管がヒト由来であることを示します。切片を、市販の抗ヒトCD31抗体を1/100に希釈して染色します。

この位相差顕微鏡像は、臍帯血由来eCFCの典型的なコンフルエント単層における、内皮細胞に特徴的な石畳状の形態を示しています。こちらの画像は、ヒト骨髄由来MSCの典型的な紡錘形形態を示しています。マウス宿主内で1週間の培養後、黄色い点線で示されたインプラントを高倍率で観察すると、宿主組織とは大きく異なる外見を呈していました。

赤血球を含む管腔構造を持つ複数の微小血管が認められ、黄色い矢印で示されています。プラグを免疫組織化学的に検査したところ、微小血管の管腔はヒトCD 31に対するモノクローナル抗体に反応しました。細胞核はヘマチンで対比染色されました。

この技術を習得すれば、適切に実施することで1オンス以内で完了させることができます。