イメージングフローサイトメトリーを用いたヒトT細胞とSEB負荷Raji細胞との間の免疫シナプスの解析

無負荷のラジ細胞と黄色ブドウ球菌エンテロトキシンBまたはSEBロードされたラジ細胞を含むフローサイトメトリーチューブを取ります。

これらのSEBを載せたRaji細胞は、クラスII MHC分子に複合体化されたスーパー抗原SEBを含む代理抗原提示B細胞として機能します。

汎白血球とインキュベートします。

T 細胞上の T 細胞受容体である TCR は、ラジ細胞上の SEB に結合し、共刺激シグナルとともに安定した細胞間結合、免疫シナプスを確立し、T 細胞の活性化につながります。

これにより、細胞内シグナル伝達経路が引き起こされ、シナプス内のシグナル伝達分子と表面受容体がクラスター化され、アクチン細胞骨格の再構成が引き

インキュベーション後、細胞を固定して細胞構造を保存します。細胞を透過処理して細胞内標的にアクセスします。

蛍光色素標識抗CD3抗体、ファロイジン、DAPIを添加し、TCR複合体、アクチンフィラメント、およびDNAのCD3にそれぞれ結合します。

イメージングフローサイトメーターを使用して、CD3およびアクチンからの蛍光シグナルを視覚化し、SEBの存在下でシナプスでのそれらの濃縮を決定します。

、1ミリリットルの抽出したばかりのヒト末梢血と30ミリリットルのACK溶解バッファーを50ミリリットルの円錐形チューブで混合します。室温で8分後、チューブにPBSを充填して遠心分離洗浄し、ペレットを2ミリリットルの培地に再懸濁して摂氏37度で60分間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、5 x 10⁵ 黄色ブドウ球菌エンテロトキシンBまたはSEBを500マイクロリットルの培地にロードまたはアンロードしたRaji細胞を個々のFACSチューブに加え、続いて650マイクロリットルの汎白血球を加えます。共培養物をスピンダウンし、ペレットを150マイクロリットルの新鮮な培地に再懸濁し、摂氏37度で45分間インキュベートします。

次に、1.5ミリリットルの1.5%パラホルムアルデヒドを加えながら、100RPMで10秒間セルを穏やかに渦にします。室温で10分後、1%BSAを添加した1ミリリットルのPBSで固定を中止し、遠心分離によって細胞を回収します。ペレットを100マイクロリットルのPBSとBSAおよび0.1%サポニンに再懸濁し、細胞サンプルを96ウェルUボトムプレートの2つの個別ウェルに加えます。

室温で15分後、プレートを遠心分離し、ペレットを50マイクロリットルのPBSとBSAおよびサポニンに再懸濁し、蛍光色素結合抗体または目的の化合物を含み、室温で暗所で30分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、細胞を150マイクロリットルのPBSとBSAおよびサポニンで3回洗浄し、ペレットを60マイクロリットルのPBSに再懸濁します。

フローサイトメトリーで細胞をイメージングするには、分析ソフトウェアを開き、液面を確認し、装置メニューの[起動]をクリックします。次に、[ロード] をクリックし、プロンプトが表示されたらサンプルをポートにロードします。

照明]タブで、励起レーザー出力を適切なナノメートル長に変更します。次に、チャンネル4と11のゲートを調整し、チャンネル1のエリアを調整します。

ゲーティングとレーザー出力の調整を評価するには、[表示]メニューをそれぞれのゲートに切り替え、セルとセルカップルが見えるまでゲートとレーザー出力を調整します。次に、[ファイル取得]タブで、サンプル名、取得する画像の数、およびCD3染色の適切なゲートを定義し、[取得]をクリックして取得を開始します。