Name: アーリーステージのニワトリ胚に成長因子コートビーズの配置 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶ 成長因子コートビーズを用いたニワトリ胚のin ovo操作法。E2.5期胚にビーズを配置し、細胞運命決定と組織分化のメカニズムを解明する発生生物学の革新的技術です。

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1。インキュベーターから卵を取り除く E2 - 2.5（〜聖17 HH）で、卵を削除し、それに応じてそれらを準備します。彼らはすぐに上に働いたり、数時間のためにインキュベーターに戻すことができます。卵は一時間以上にわたって安全に、室温で置くことができます。卵は操作の間、外滞在することができます。時には、これらは1時間以上かかる可能性が。 注 ：長い彼らは室温で座って、可能性は低く、彼らが生き残るためです。 2。インドインクの調製<ol><li>滅菌PBS中4％、インドのインクの新鮮な溶液を調製します。 </li><li>溶液で3 mLシリンジを埋める。 </li><li>注射器で27ゲージ、½インチの針を置きます。 </li><li>止血のペアを使用して、90 °の角度に針を曲げる。 </li></ol> 3。墨汁の卵と注射を開く<ol><li>バックテープをはがし、ピンセットを使うと卵の裏面にテープの裏面を使用して、それを固定して、ウィンドウを開きます。 </li><li>それは単に胚の下にあるまで、斜めに針でガイド。フローティングディスクの下に針を置くことは、胚への毒性がインクは、、直接接触しないことが保証される。 </li><li>あなただけの快適なコントラストを作成するのに十分なインクを注入する必要があります。これは通常、¼ mLの未満です。 </li></ol> 4。神経管を開く<ol><li>細かい解剖ハサミを取ると上部にある薄い膜、または時々周り、胚をカット。 </li><li> 55ピンセットまたはタングステンプローブを取り、後方から前方に神経管を開きます。開口部がそれにビーズを配置するのに十分な大きさであることを確認してください。 </li></ol> 注 ：年齢に応じて、微細なタングステンプローブが同じことを行うために使用することができます。 5。コー​​ティングされたヘパリン-アクリルビーズを取得<ol><li> 55ピンセットを用いて、溶液中で完全なビーズを見つける。ビーズが先端に付着させ、徐々に鉗子を閉じてください。 </li><li>ソリューションからビーズを取り出して、卵の上にそれを引き入れる。 </li><li>ビーズは、その溶液からしたらそれはアルブミンに置かれるまで、それは可能性が高いから来ることはありません。 </li></ol> 6。ビーズの配置<ol><li>ビーズは、ターゲット領域の上に配置されると、脳に向かってそれを導くか、後脳でそれを修正するタングステン探針を使用してください。 </li><li> 10μLピペットを用いてPBSを数滴を追加します。 </li></ol> 7。卵を閉じる<ol><li>ウィンドウをシャットダウンするテープの薄い部分を使って卵を閉じます。 </li><li>で利用可能な準備中のプロトコルに従って卵、封印<a href="http://jove.com/index/Details.stp?ID=306" target="_blank">http://jove.com/index/Details.stp?ID=306を</a> 。 </li></ol>

<ol><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+Chicken+Eggs+for+Developmental+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies.</a> Jounal of Visualized Experiments. 8, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> (2007).</li>
<li>Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+expression+of+Fgf8%2C+Otx2%2C+Bmp4%2C+and+Shh+in+the+rostral+prosencephalon+during+development+of+the+telencephalic+and+optic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles.</a> Neuroscience. 108, 183-206 (2001).</li>
<li>Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulations+by+FGF8+contribute+to+midbrain+roof+plate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity.</a> Development . 133, 2905-2913 (2006).</li>
</ol>

著者は開示すべき事項を有していない。

使用したい蛋白質に応じて、ビーズを準備する方法の別のプロトコルがあります。これらの実験では、我々はヘパリン - アクリルビーズを使用しますが、アフィ - ゲルのビーズを使用することもできます。我々はヘパリン - アクリルビーズは、卵アルブミンの水溶液環境での操作が容易であることを見出した。ビーズは4℃で一晩タンパク質の5リットルに浸漬されていますコントロールビーズを配置するまで滅菌PBSに配置されます。 OVOの準備に使用する利点は、胚がまだ生きていると、通常は1を開発するために自由であるということです。外植片が保持される環境が特定の変数のために制御することもできますが、生きている胎児は発達パターン上のタンパク質2-3の影響を正確に表現することができます。すべてのアッセイでは、外植片に実行できることは、胚の場合とすることができます。

<table><tbody><tr><td>卵</td><td>動物</td><td></td><td></td><td>受精卵、E2-2.5 (~ St. 17 HH)</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>Profi-I</td><td>Lyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インディアインク</td><td>ツール</td><td>Higgins</td><td></td><td>滅菌PBSを用いて4%溶液を調製する。</td></tr><tr><td>滅菌PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>あるいは、抗体カクテルも使用可能</td></tr><tr><td>1mlシリンジ</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G 1/2針</td><td>ツール</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td>90度に角度をつける</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>ツール</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>サイズ 55</td></tr><tr><td>止血鉗子</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖用はさみ</td><td>ツール</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500086</td><td>バナス型、8.5cm</td></tr><tr><td>パラフィルムテープ</td><td></td><td></td><td></td><td>卵の密封用</td></tr><tr><td>タングステンプローブ</td><td>ツール</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td>ツール #24。ハンドルは任意。</td></tr></tbody></table>

アーリーステージのニワトリ胚に成長因子コートビーズの配置

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

神経管は、開発中に特定の時空間パターンで多くのタンパク質を発現する。これらのタンパク質は、細胞の運命決定、細胞移動、および神経回路の形成に重要であることが示されている。神経誘導とパターン形成は、骨形成タンパク質（BMP）、ソニックヘッジホッグ（SHH）、特に線維芽細胞増殖因子（FGF）を、含む。特に、FGF8の発現パターンは、BMP4およびSHHを発現している地域に近接している。この発現パターンは、終脳のパターン形成を促進する発達の相互作用と一致している。 ここでは、OVOの準備の前脳形成におけるFGFの効果をテストするために使用可能なメソッドの視覚的なデモンストレーションを提供しています。ビーズは、タンパク質でコーティングし、持続的な露出を提供するために開発し、神経管に配置されます。プロシージャが小さい、慎重に配置されたビーズを使用しているので、それは低侵襲であり、いくつかのビーズは、単一の神経管の中に配置することができます。また、この方法は、胚が解剖学および神経パターン形成の変化を検出するために、より成熟した段階で分析できるように継続的な開発が可能になります。この単純だが有用なプロトコルは、リアルタイムイメージングが可能になります。それは、内因性のタンパク質レベルに空間的かつ時間的に限られた変更を行う手段を提供します。

成長因子や様々なタンパク質は、開発中に別の細胞の運命を引き受ける細胞を誘導するために相互作用する。ここでは、E2.5のニワトリ胚にビーズを配置することにより、開発の異なるタンパク質間の相互作用の可能性に対処するためにOVO準備での使用を示します。

神経管は、発生過程において多くのタンパク質を特定の時空間パターンで発現します。これらのタンパク質は、細胞の...に不可欠であることが示されています。

Raburn Labへようこそ。私はカリフォルニア大学アーバイン校、神経生物学・行動学部のMatt Kornです。本日は、卵を開き、成長因子に浸漬させたビーズを配置する手法について説明します。卵の適切な準備を行うことで、胚発生のこの初期段階において、さまざまな種類の組織の運命を変える成長因子を導入することが可能になります。2.5日目、すなわちステージ17です。それでは、顕微鏡での観察に移ります。卵と道具はすべて揃っています。それでは、卵を一つ取り出してください。ここにテープがあります。ウィンドウシールです。ここに、小さなドーナツを用意しました。これは画材店で購入できるアーティスティッククレイで作られています。そして、非常に精度の低いピンセットを使用します。これらはかなり前から使っています。先端部分はかなり摩耗していますが、ウィンドウを上げるのに十分な程度にテープを浮かせるには最適です。これらを配置します。このように折り畳んで、卵を、このウィンドウを後ろ側に固定します。これで、顕微鏡下に置いて、あらゆる操作を行うことができます。今回はビーズを使用しますので、これからインディアインクを用意します（インディアインクがない状態です）。ここに胚盤が見えますが、少し横にずれています。卵を回転させると、血液が円状に形成されている箇所が確認できます。それでは、インディアインクを入れた針を準備します。ここで一度脇に避け、ディスクの下に入れます。そこには胚があります。胚が黒い背景に対してコントラストで見える程度にのみ挿入します。その後、胚の吻側が前方に向くように回転させます。ここで見えているのが頭部領域です。神経管がここにまで戻っており、体節があるため、個体齢を判定することができます。さらにズームすると、心臓が非常にゆっくりですが、一定のリズムで拍動しているのが分かります。これは非常に良い状態です。心臓はそこにありましたが、拍動していませんでした。これが生存サンプルであるかどうかについては、少し懸念する必要があります。心臓を覆う厚い膜が実質的に存在しないため、そのままタングステンプローブを使用します。ここに薄い膜がありますので、胚にアクセスできるように端に寄せます。ビーズを前脳と後脳の両方に配置します。今回は、前脳を対象にします。さて、そこに到達させるためには、膜を切断する必要があります。個体がより若い段階であれば、タングステンプローブを用いて神経管から進入し、ビーズを留置したい領域にアクセスすることが可能です。それでは、タングステンプローブを使用します。手の震えを抑えるために両手を使っています。ここから胚を操作します。ビーズをここに導入できれば、神経管の中を通り、前脳まで直接配置することができます。それでは、胚を開きましたので、準備を整えてビーズを留置します。まず、プローブを少し深く差し込んで神経管を開きます。こちらで開いたのがご確認いただけます。もう少し拡大してみましょう。ここで、焦点を少し調整します。このように小さな開口部が見えますが、尾頭部の上の部分には穴を開けていません。その理由は、そこにビーズを配置するためです。ビーズが浮き出して出てきてしまうような穴は作りたくありません。ビーズを挿入して前方に押し出せるように、少し後ろに下げておきます。それでは、ビーズを用意します。このように、さまざまなサイズがあることがわかります。これらはヘパリンアクリルで、PBS中にあります。55番のピンセットを用いて、PBSの中から好ましいものを1つ選びます。PBSから出した後、通常はピンセットに付着します。ここで確認できます。そのままビーズを覆ってください。卵を戻します。卵にピントを合わせます。それでは、55番のピンセットでビーズを運んできます。好みの位置よりは少し高いところを掴んでいますが、これで大丈夫です。そして、神経管に開けた穴の方へ、ゆっくりと誘導します。一度神経管に入れば、発達中の脳の前方へと容易に操作できるようになります。それでは、タングステンプローブを用いて、そのまま押し進めます。ビーズを頭部に配置する際は注意が必要です。胚が成長するにつれて、前方に曲がり、その後側方に曲がり始めるためです。前脳（頭部）にビーズを配置する際、多くの場合はクチバシの方へ落ちてしまいます。これは、脳が背側に位置するのに対し、クチバシは胚の腹側に形成されるためです。しかし、これは良好に見えます。これで十分だと思われます。10 µLの滅菌PBSを入れたピペットを使い、ここに数滴滴下します。それでは、卵を閉じます。ここで、ウィンドウを上に持ち上げて被せますが、卵はまだ密封されていません。乾燥を防ぐため、これまで使用していたプラスチックテープを、ウィンドウよりわずかに大きいサイズに切り取って使用します。これを少しだけ伸ばして、こちらのウィンドウの真上に配置し、しっかりと密着させます。これにより、アルブミンの排出時やウィンドウの切り出し時にできた穴がすべて封鎖されます。これで卵が密封され、ウミンが失われることも、乾燥することもない状態になります。正常に成長させる必要があります。以上でビーズの留置について説明しました。雛の実験がうまくいくことを願い、期待通りの結果が得られることを願っております。

placing-growth-factor-coated-beads-on-early-stage-chicken-embryos

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JoVE Journal

Biology

生物学

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浸漬ビーズアッセイを用いたニワトリ胚発生時の細胞分化、形態形成、パターニングの解析

学ぶ 成長因子コートビーズを用いたニワトリ胚のin ovo操作法。E2.5期胚にビーズを配置し、細胞運命決定と組織分化のメカニズムを解明する発生生物学の革新的技術です。

アーリーステージのニワトリ胚に成長因子コートビーズの配置

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