Name: アーリーステージのニワトリ胚に成長因子コートビーズの配置 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶ 成長因子コートビーズを用いたニワトリ胚のin ovo操作法。E2.5期胚にビーズを配置し、細胞運命決定と組織分化のメカニズムを解明する発生生物学の革新的技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1。インキュベーターから卵を取り除く E2 - 2.5（〜聖17 HH）で、卵を削除し、それに応じてそれらを準備します。彼らはすぐに上に働いたり、数時間のためにインキュベーターに戻すことができます。卵は一時間以上にわたって安全に、室温で置くことができます。卵は操作の間、外滞在することができます。時には、これらは1時間以上かかる可能性が。 注 ：長い彼らは室温で座って、可能性は低く、彼らが生き残るためです。 2。インドインクの調製<ol><li>滅菌PBS中4％、インドのインクの新鮮な溶液を調製します。 </li><li>溶液で3 mLシリンジを埋める。 </li><li>注射器で27ゲージ、½インチの針を置きます。 </li><li>止血のペアを使用して、90 °の角度に針を曲げる。 </li></ol> 3。墨汁の卵と注射を開く<ol><li>バックテープをはがし、ピンセットを使うと卵の裏面にテープの裏面を使用して、それを固定して、ウィンドウを開きます。 </li><li>それは単に胚の下にあるまで、斜めに針でガイド。フローティングディスクの下に針を置くことは、胚への毒性がインクは、、直接接触しないことが保証される。 </li><li>あなただけの快適なコントラストを作成するのに十分なインクを注入する必要があります。これは通常、¼ mLの未満です。 </li></ol> 4。神経管を開く<ol><li>細かい解剖ハサミを取ると上部にある薄い膜、または時々周り、胚をカット。 </li><li> 55ピンセットまたはタングステンプローブを取り、後方から前方に神経管を開きます。開口部がそれにビーズを配置するのに十分な大きさであることを確認してください。 </li></ol> 注 ：年齢に応じて、微細なタングステンプローブが同じことを行うために使用することができます。 5。コー​​ティングされたヘパリン-アクリルビーズを取得<ol><li> 55ピンセットを用いて、溶液中で完全なビーズを見つける。ビーズが先端に付着させ、徐々に鉗子を閉じてください。 </li><li>ソリューションからビーズを取り出して、卵の上にそれを引き入れる。 </li><li>ビーズは、その溶液からしたらそれはアルブミンに置かれるまで、それは可能性が高いから来ることはありません。 </li></ol> 6。ビーズの配置<ol><li>ビーズは、ターゲット領域の上に配置されると、脳に向かってそれを導くか、後脳でそれを修正するタングステン探針を使用してください。 </li><li> 10μLピペットを用いてPBSを数滴を追加します。 </li></ol> 7。卵を閉じる<ol><li>ウィンドウをシャットダウンするテープの薄い部分を使って卵を閉じます。 </li><li>で利用可能な準備中のプロトコルに従って卵、封印<a href="http://jove.com/index/Details.stp?ID=306" target="_blank">http://jove.com/index/Details.stp?ID=306を</a> 。 </li></ol>

<ol><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+Chicken+Eggs+for+Developmental+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies.</a> Jounal of Visualized Experiments. 8, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> (2007).</li>
<li>Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+expression+of+Fgf8%2C+Otx2%2C+Bmp4%2C+and+Shh+in+the+rostral+prosencephalon+during+development+of+the+telencephalic+and+optic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles.</a> Neuroscience. 108, 183-206 (2001).</li>
<li>Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulations+by+FGF8+contribute+to+midbrain+roof+plate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity.</a> Development . 133, 2905-2913 (2006).</li>
</ol>

著者は開示すべき事項を有していない。

使用したい蛋白質に応じて、ビーズを準備する方法の別のプロトコルがあります。これらの実験では、我々はヘパリン - アクリルビーズを使用しますが、アフィ - ゲルのビーズを使用することもできます。我々はヘパリン - アクリルビーズは、卵アルブミンの水溶液環境での操作が容易であることを見出した。ビーズは4℃で一晩タンパク質の5リットルに浸漬されていますコントロールビーズを配置するまで滅菌PBSに配置されます。 OVOの準備に使用する利点は、胚がまだ生きていると、通常は1を開発するために自由であるということです。外植片が保持される環境が特定の変数のために制御することもできますが、生きている胎児は発達パターン上のタンパク質2-3の影響を正確に表現することができます。すべてのアッセイでは、外植片に実行できることは、胚の場合とすることができます。

<table><tbody><tr><td>卵</td><td>動物</td><td></td><td></td><td>受精卵、E2-2.5 (~ St. 17 HH)</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>Profi-I</td><td>Lyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インディアインク</td><td>ツール</td><td>Higgins</td><td></td><td>滅菌PBSを用いて4%溶液を調製する。</td></tr><tr><td>滅菌PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>あるいは、抗体カクテルも使用可能</td></tr><tr><td>1mlシリンジ</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G 1/2針</td><td>ツール</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td>90度に角度をつける</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>ツール</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>サイズ 55</td></tr><tr><td>止血鉗子</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖用はさみ</td><td>ツール</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500086</td><td>バナス型、8.5cm</td></tr><tr><td>パラフィルムテープ</td><td></td><td></td><td></td><td>卵の密封用</td></tr><tr><td>タングステンプローブ</td><td>ツール</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td>ツール #24。ハンドルは任意。</td></tr></tbody></table>

アーリーステージのニワトリ胚に成長因子コートビーズの配置

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

神経管は、開発中に特定の時空間パターンで多くのタンパク質を発現する。これらのタンパク質は、細胞の運命決定、細胞移動、および神経回路の形成に重要であることが示されている。神経誘導とパターン形成は、骨形成タンパク質（BMP）、ソニックヘッジホッグ（SHH）、特に線維芽細胞増殖因子（FGF）を、含む。特に、FGF8の発現パターンは、BMP4およびSHHを発現している地域に近接している。この発現パターンは、終脳のパターン形成を促進する発達の相互作用と一致している。 ここでは、OVOの準備の前脳形成におけるFGFの効果をテストするために使用可能なメソッドの視覚的なデモンストレーションを提供しています。ビーズは、タンパク質でコーティングし、持続的な露出を提供するために開発し、神経管に配置されます。プロシージャが小さい、慎重に配置されたビーズを使用しているので、それは低侵襲であり、いくつかのビーズは、単一の神経管の中に配置することができます。また、この方法は、胚が解剖学および神経パターン形成の変化を検出するために、より成熟した段階で分析できるように継続的な開発が可能になります。この単純だが有用なプロトコルは、リアルタイムイメージングが可能になります。それは、内因性のタンパク質レベルに空間的かつ時間的に限られた変更を行う手段を提供します。

成長因子や様々なタンパク質は、開発中に別の細胞の運命を引き受ける細胞を誘導するために相互作用する。ここでは、E2.5のニワトリ胚にビーズを配置することにより、開発の異なるタンパク質間の相互作用の可能性に対処するためにOVO準備での使用を示します。

神経管は、発生過程において多くのタンパク質を特定の時空間パターンで発現します。これらのタンパク質は、細胞の...に不可欠であることが示されています。

Raburn Labへようこそ。私はカリフォルニア大学アーバイン校、神経生物学・行動学部のMatt Kornです。本日は、卵を開き、成長因子に浸漬させたビーズを配置する手法について説明します。卵の適切な準備を行うことで、胚発生のこの初期段階において、さまざまな種類の組織の運命を変える成長因子を導入することが可能になります。2.5日目、すなわちステージ17です。それでは、顕微鏡での観察に移ります。卵と道具はすべて揃っています。それでは、卵を一つ取り出してください。ここにテープがあります。ウィンドウシールです。ここに、小さなドーナツを用意しました。これは画材店で購入できるアーティスティッククレイで作られています。そして、非常に精度の低いピンセットを使用します。これらはかなり前から使っています。先端部分はかなり摩耗していますが、ウィンドウを上げるのに十分な程度にテープを浮かせるには最適です。これらを配置します。このように折り畳んで、卵を、このウィンドウを後ろ側に固定します。これで、顕微鏡下に置いて、あらゆる操作を行うことができます。今回はビーズを使用しますので、これからインディアインクを用意します（インディアインクがない状態です）。ここに胚盤が見えますが、少し横にずれています。卵を回転させると、血液が円状に形成されている箇所が確認できます。それでは、インディアインクを入れた針を準備します。ここで一度脇に避け、ディスクの下に入れます。そこには胚があります。胚が黒い背景に対してコントラストで見える程度にのみ挿入します。その後、胚の吻側が前方に向くように回転させます。ここで見えているのが頭部領域です。神経管がここにまで戻っており、体節があるため、個体齢を判定することができます。さらにズームすると、心臓が非常にゆっくりですが、一定のリズムで拍動しているのが分かります。これは非常に良い状態です。心臓はそこにありましたが、拍動していませんでした。これが生存サンプルであるかどうかについては、少し懸念する必要があります。心臓を覆う厚い膜が実質的に存在しないため、そのままタングステンプローブを使用します。ここに薄い膜がありますので、胚にアクセスできるように端に寄せます。ビーズを前脳と後脳の両方に配置します。今回は、前脳を対象にします。さて、そこに到達させるためには、膜を切断する必要があります。個体がより若い段階であれば、タングステンプローブを用いて神経管から進入し、ビーズを留置したい領域にアクセスすることが可能です。それでは、タングステンプローブを使用します。手の震えを抑えるために両手を使っています。ここから胚を操作します。ビーズをここに導入できれば、神経管の中を通り、前脳まで直接配置することができます。それでは、胚を開きましたので、準備を整えてビーズを留置します。まず、プローブを

placing-growth-factor-coated-beads-on-early-stage-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、大脳皮質の外植片に、成長因子でコーティングされたビーズを、準備して置くための2つの方法を示しています。これらのビーズは、前脳の外植片のような神経組織の開発に空間的に制限された遺伝子の発現を誘導するために使用することができます。メソッドは、アッフィ -...

背側前脳の外植片上に成長因子-コーティングビーズの配置

このビデオでは、新しい文化、最大24時間までのニワトリ胚が卵の外側に培養される方法を示しています。このメソッドは1つが、マウスのE7 - 9に相当する期間を早期に開発を（14 SOMの原条。）勉強することができます。この技術のアプリケーションでは、in...

初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

この記事では、表面のラベルを説明し、...

初期のニワトリ胚の形態形成の組織の変形を追跡

クロス種の移植による神経堤の移行および分化の解析

発生中にニワトリの胚を見てアクセスすることは困難な場合があります。私たちは、シンプルで費用対効果が高く、教室や研究現場で簡単に使用できるex ovo法を開発しました。この方法は、胚発生の後期段階(HH...

最適化された元OVO開発の進んだ段階にニワトリ胚の培養

ここでは、血管内DiI注射と組み合わせたひよこGFP 神経管の種内移植を用いた神経堤細胞および血管の二重標識を報告する。この実験技術により、臓器形成中にNCC由来の(腸管)神経系と血管系の発達を同時に可視化し、研究することができます。...

鶏の胚内の神経堤細胞と血管の二重標識は、ひよこGFP 神経管移植とカルボシアニンDyI注射を用いた

成長因子またはシグナル伝達経路の特定の阻害剤に浸したビーズを発生中の胚に移植することにより、それらの効果を生体内で直接テストすることが可能です。このプロトコルでは、ビーズを四肢の芽に移植して、これらの分子が遺伝子発現とシグナル伝達に及ぼす影響を決定します。...

遺伝子発現に影響を​​及ぼすシグナル伝達経路を同定するために、ニワトリ胚手足の開発にビーズのグラフト

&gt;jove_content&lt;手足の形成に必要なニワトリ胚の本体軸と脇腹の組織間の誘導イベントを阻止するために不透過性バリアを使用するプロトコルが説明されています。候補誘導性シグナルに浸したビーズは、バリア配置の影響を克服するために使用され、遺伝子発現の解析によりこれが確認されています。...

チックに誘導シグナルを研究するために、候補因子浸しビーズと組み合わせることで不浸透性の障壁の応用

ここでは、透過光と蛍光顕微鏡を用いたタイムラプスイメージングのためのニワトリ胚ex...

長期用水中フィルターペーパーサンドイッチ例OVOタイムラプスイメージング

この方法では胚の心臓組織は外科的 microdissected、解離、蛍光標識、そして宿主胚性組織に注入です。これは個人または組織レベル発達組織下異所性血行力学的条件、および/またはパラクリン/juxtacrine...

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

浸漬ビーズアッセイは、細胞分化および形態形成の調節を研究するために、任意の発生時点で試験試薬の標的送達を含む。任意の実験動物モデルに適用可能な、3つの異なるタイプの浸漬ビーズを調製し、これらをニワトリ胚の桁間に移植するための詳細なプロトコールが提示される。...

浸漬ビーズアッセイを用いたニワトリ胚発生時の細胞分化、形態形成、パターニングの解析

学ぶ 成長因子コートビーズを用いたニワトリ胚のin ovo操作法。E2.5期胚にビーズを配置し、細胞運命決定と組織分化のメカニズムを解明する発生生物学の革新的技術です。

アーリーステージのニワトリ胚に成長因子コートビーズの配置

さらに動画を探す