肥満細胞の分泌顆粒のエキソサイトーシスを可視化するIn Vitro技術

肥満細胞(炎症性メディエーターを含む分泌顆粒を持つ免疫細胞、またはSG)を含むチャンバー付きカバーグラスを取ります。

IgE抗体をpH感受性蛍光レポーターとともに添加し、インキュベートします。

抗体はマスト細胞上のFc受容体に結合します。レポーターは飲作用によって内面化され、結果として生じるエンドソームはSGと融合します。

メディアを取り出します。複数のIgE結合エピトープを含む抗原を追加します。スライドを蛍光顕微鏡下に置き、必要な励起波長を適用します。

SGの酸性pHはレポーター蛍光を消光する

抗原は細胞表面のIgE受容体複合体に結合し、それらを架橋します。

抗原を介した受容体凝集は、SGが原形質膜に向かって移動するきっかけとなります。

血漿およびSG膜上のSNAREタンパク質は、エキソサイトーシスと呼ばれる膜融合およびSG貨物の排出を媒介します。

培地のpHが高いとSGアルカリ化が引き起こされ、レポーターが蛍光を取り戻すよう誘導されます。

入ってくるSGは、メンブレンで融合したSGと融合します。第2SGのアルカリ化は蛍光回復を媒介し、複合エキソサイトーシスを確認します。

10マイクロリットルの細胞懸濁液を、新鮮なFITC-デキストランを添加した培地を入れたチャンバー付きカバーガラスに加え、RBL細胞を一晩増殖させます。まず、テキストプロトコルに従って最終的なTyrodeの緩衝液を調製します。次に、作りたてのバッファーに20倍の分泌促進剤試薬を調製します。

塩化アンモニウム粉末をチロデの緩衝液に溶解して、400ミリモルの塩化アンモニウム溶液を作成します。次に、チャンバー付きカバーガラスから培地を吸引し、300マイクロリットルの予熱したTyrodeのバッファーと交換します。洗浄プロセスを2回繰り返した後、チャンバーに300マイクロリットルのTyrodeのバッファーを補充します。

次に、チャンバー付きカバーグラスを顕微鏡のインキュベーターチャンバーに入れ、チャンバーが安定していることを確認します。蛍光灯をオンにして、適切な蛍光フィルターを選択します。視野の中央に関心領域に焦点が合ったら、光源をオフにします。

次に、約500〜550ナノメートルの発光を集めた488ナノメートルのレーザーをオンにします。次に、画像取得間の時間間隔を調整します。スキャン方向を「双方向」に設定します。平均化は許可しません。ピンホールを開き、解像度を 512 x 512 に設定します。

次に、特定の細胞型または分泌促進剤に適した期間、細胞を画像化します。次に、分泌促進剤溶液から16マイクロリットルをチャンバーに加え、撮影を続けます。最後に、分泌顆粒へのFITC-デキストランの存在と局在を確認するために、16マイクロリットルの塩化アンモニウム溶液をチャンバーにそっと加えます。