Name: に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌 /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: 学ぶリステリア感染マウスの細菌負荷測定と肝臓・脾臓からの単細胞懸濁液調製法。FACS解析による免疫応答評価と感受性・抵抗性マウス系統間の比較が可能です。

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著者らは、アドバイスや試薬のためアンナWalduck、クリスティーナ乾杯、スチュアートBerzins、デイルゴッドフリー、伊帆展とジョナサンWilkschに感謝します。この作品は、少年糖尿病研究財団（1-2008-602）とオーストラリア国立保健医療研究評議会（575552）によって賄われていた。 NWは、オーストラリアの大学院賞でサポートされています。 OWは、オーストラリア国立保健医療研究評議会からRDライトフェローシップでサポートされています。

<ol><li>Wing, E. J., Gregory, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+clinical+and+experimental+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: clinical and experimental update.</a> J Infect Dis. 185, Suppl 1. S18-S24 (2002).</li>
<li>Conlan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+host-pathogen+interactions+in+the+liver+and+spleen+during+systemic+murine+listeriosis%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Early host-pathogen interactions in the liver and spleen during systemic murine listeriosis: an overview.</a> Immunobiology. 201, 178-187 (1999).</li>
<li>Neuenhahn, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+functions+of+splenic+CD8alpha%2B+dendritic+cells+during+infection+with+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Unique functions of splenic CD8alpha+ dendritic cells during infection with intracellular pathogens.</a> Immunol Lett. 114, 66-72 (2007).</li>
<li>Cousens, L. P., Wing, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+defenses+in+the+liver+during+Listeria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate defenses in the liver during Listeria infection.</a> Immunol Rev. 174, 150-159 (2000).</li>
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<li>Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to Listeria monocytogenes.</a> Nat Rev Immunol. 4, 812-823 (2004).</li>
<li>Cheers, C., McKenzie, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+and+susceptibility+of+mice+to+bacterial+infection%3A+genetics+of+listeriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Resistance and susceptibility of mice to bacterial infection: genetics of listeriosis.</a> Infect Immun. 19, 755-762 (1978).</li>
<li>Garifulin, O., Boyartchuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+as+a+probe+of+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes as a probe of immune function.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 4, 258-269 (2005).</li>
<li>Gervais, F., Stevenson, M., Skamene, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+resistance+to+Listeria+monocytogenes%3A+regulation+of+leukocyte+inflammatory+responses+by+the+Hc+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of resistance to Listeria monocytogenes: regulation of leukocyte inflammatory responses by the Hc locus.</a> J Immunol. 132, 2078-2083 (1984).</li>
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<li>Boyartchuk, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigenic+control+of+Listeria+monocytogenes+susceptibility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Multigenic control of Listeria monocytogenes susceptibility in mice.</a> Nat Genet. 27, 259-260 (2001).</li>
<li>Boyartchuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+resistance+locus+sst1+controls+innate+immunity+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The host resistance locus sst1 controls innate immunity to Listeria monocytogenes infection in immunodeficient mice.</a> J Immunol. 173, 5112-5120 (2004).</li>
<li>Pan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipr1+gene+mediates+innate+immunity+to+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ipr1 gene mediates innate immunity to tuberculosis.</a> Nature. 434, 767-772 (2005).</li>
<li>Garifulin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irf3+polymorphism+alters+induction+of+interferon+beta+in+response+to+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Irf3 polymorphism alters induction of interferon beta in response to Listeria monocytogenes infection.</a> PLoS Genet. 3, 1587-1597 (2007).</li>
<li>Hof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+different+strains+of+Listeria+monocytogenes+serovar+1%2F2a%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Microbiol+Immunol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Virulence of different strains of Listeria monocytogenes serovar 1/2a.</a> Med Microbiol Immunol (Berl. 173, 207-218 (1984).</li>
<li>Wollert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+host+range+of+Listeria+monocytogenes+by+rational+protein+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design.</a> Cell. 129, 891-902 (2007).</li>
<li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+model+for+listeriosis%3A+role+of+internalin+in+crossing+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier.</a> Science. 292, 1722-1725 (2001).</li>
<li>Marco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+infected+by+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route.</a> Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).</li>
<li>Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+in+mouse+models+of+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DCs in mouse models of intracellular bacterial infection.</a> Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).</li>
<li>Conlan, J. W., North, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+essential+for+early+anti-Listeria+defense+in+the+liver%2C+but+not+in+the+spleen+or+peritoneal+cavity%2C+as+revealed+by+a+granulocyte-depleting+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 179, 259-268 (1994).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+antigranulocyte+monoclonal+antibody+RB6-8C5+prevents+expression+of+acquired+resistance+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+previously+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice.</a> Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

Listeriaは、細胞内細菌に対する宿主の免疫応答を特性解析するために最も広く利用されている生物の一つである6。本プロトコルでは、特定のマウスの同一組織内において、細菌量と免疫細胞応答の両方を測定することが可能となる。感染マウスごとに特定の組織からこれら2つの指標を測定することで、マウスコホート内（異なるマウス系統または感染後の異なる時点）およびコホート間でのより堅牢な比較が可能になる。経口投与によるListeria感染を用いてマウスの免疫応答を研究することも可能だが、静脈内注射による感染が頻繁に用いられる理由は以下の通りである：1) 血流への迅速かつ効果的な導入が保証されるため、2) 同期した一貫性のある全身感染が誘導されるため、そして3) Mus属はE-カドヘリン受容体をコードする遺伝子に突然変異を有しており、これが経口投与によるListeria感染を制限しているため（この変異は、ListeriaがマウスのE-カドヘリン受容体に結合し、胃腸管の上皮層を効率的に通過する能力に影響を与える）16-18。
このプロトコルには、いくつかの重要なステップがあります。まず、生存率と毒性を確保するため、Listeria接種株は新鮮なHBA overnight培養液から調製する必要があります。次に、最初に接種したマウスと最後に接種したマウスの間でCFU濃度に大きな差が生じないように、すべてのマウスへの接種前後に接種株のCFU濃度を正確に測定することが重要です。第三に、マウスへのListeriaの尾静脈注射は、すべての個体で一貫して行う必要があります。最後に、末梢血中を通過する白血球ではなく、肝臓内の免疫細胞を正確に測定するために、肝臓を灌流して非定在性白血球を除去させる必要があります。これらのステップのいずれかが適切に行われない場合、Listeriaに感染させた個々のマウス間で、細菌量や免疫反応に不要なばらつきが生じる可能性があります。
本プロトコルの2つの制限事項は、静脈注射によるマウス感染させる研究者のスキルと、組織内における細菌量の検出です。1人の担当者が多数のマウスに注射を行う場合、凍結保存した接種液を融解してから時間が経過すると（例：最初のマウスと最後のマウスへの注射の間隔が&gt;2時間）、Listeriaの生存率（すなわちCFU濃度）が低下する可能性があります。接種液の品質が損なわれる前に何匹のマウスに注射できるかは、研究者が判断する必要があります。本手法のもう一つの制限は、培養した組織ホモジネートの量が比較的少ないため、1器官あたり100CFU未満のListeria量は正確に測定できないことです（例：図3は、検出限界が100CFU/organであることを示しています）。1器官あたりのCFUのより低い値をより正確に測定するには、より多くの量の組織ホモジネートを培養することで（1プレートあたり最大0.5mL、複数プレートの使用が可能）、Listeria検出のためにサンプリングされる組織の割合を増やすことができます。ストマッカー（Stomacher）が利用できない場合は、ステップ7.1-7.2において、組織ホモジナイザーなどの代替的な組織ホモジナイズ方法を使用できます。実用的な注意点として、感染マウスからの組織サンプルの培養に用いる37°Cインキュベーターのスペースが限られている場合は、HBA培養プレートを室温で2〜3日間インキュベートすることも可能です（室温ではコロニーの増殖速度は遅くなります）。ただし、凍結保存用Listeriaストックを調製するための培養を行う際は、室温を使用しないでください。
このプロトコールは、マウスにおけるListeria感染を特性評価するための基本的なアプローチを提供するものであり、EGD以外の他のListeria株にも適用可能です。肝臓および脾臓に加えて、リンパ節から単一細胞懸濁液を作製することもできます。いずれの場合においても、これらの単一細胞懸濁液は、免疫細胞サブセットの測定や、ソートした免疫細胞のin vitro刺激など、さまざまな解析に使用できます。基本的な手法を習得すれば、このプロトコールを修正して、Listeria特異的T細胞の単離19、樹状細胞の特性評価20、あるいは感染後の特定の時点における免疫細胞の除去21,22を行い、Listeria感染マウスにおける免疫応答をより詳細に特性評価することが可能です。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>馬血液寒天ベース2号</td><td>オキソイド</td><td> CM0271 </td><td> HBAプレート用寒天ベースの準備</td></tr><tr><td>馬の血（繊維素） </td><td>オキソイド</td><td> HB1000 </td><td>寒天ベースに5〜10％を加算</td></tr><tr><td>ブレインハートインフュージョン（BHI）ブロス（10mL）を</td><td>オキソイド</td><td> TM456 </td><td></td></tr><tr><td>脳心臓浸出液乾燥メディア</td><td>オキソイド</td><td> CM1135 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェル平底プレート</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 70μmのセルストレーナー</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td>小さなペトリ皿</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td>ストマッカー80バイオマスターラボシステム</td><td>スワード</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチックストマッカー袋</td><td>ザルスタット</td><td> 86 9924 530 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> FACSバッファー</td><td></td><td></td><td> 0.1％（w / v）のPBSに牛血清アルブミン</td></tr><tr><td>等張パーコール（33.75パーセントPBSでパーコール） </td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-0891-01 </td><td> 33.75mLパーコール、3.75mL 10倍PBS、62.5mL 1X PBSは、100mLの等張パーコールしています</td></tr><tr><td> TACバッファ</td><td></td><td></td><td> 17mmのトリス、蒸​​留水で140mmの塩化アンモニウム</td></tr><tr><td> FCS / EDTA緩衝液</td><td></td><td></td><td> 10mMのEDTAとウシ胎児血清</td></tr><tr><td> FACS / EDTA緩衝液</td><td></td><td></td><td> FACSバッファ+ 5mMのEDTA </td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>シグマ</td><td> T6146 </td><td> PBSの0.4％（w / v）の、滅菌フィルタ</td></tr><tr><td> 2mLのクライオバイアル</td><td>グライナーバイオワン</td><td> 121263 </td><td></td></tr><tr><td> 27 gauge/1mLインスリン注射器</td><td>テルモメディカルプロダクツ</td><td> SS10M2713 </td><td></td></tr><tr><td>針</td><td>テルモメディカルプロダクツ</td><td> NN - 2516R（25G 5/8in） NN - 2613R（26G 2インチ） </td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>テルモメディカルプロダクツ</td><td> SS - 01T（1mLの）、SS - 053（5ml）を、SS - 10S（10ml）を</td><td></td></tr></tbody></table>

に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌</em

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

リステリア菌は、（リステリア）グラム陽性通性細胞内病原体は1です。マウスの研究では、通常、全身感染症2の結果リステリアの静脈内注射を、採用しています。注入後、リステリアはすぐにCD8α+樹状細胞とクッパー細胞3,4による取り込みのために脾臓や肝臓に発信しています。一度貪食、様々な細菌タンパク質は、ファゴソームから逃れるためにリステリアを有効細胞質ゾル内で生き残る、と5隣接する細胞に感染。感染の最初の3日間、別の生来の免疫細胞（例えば単球、好中球、NK細胞、樹状細胞） リステリアの増殖を抑える殺菌のメカニズムを媒介する。 CD8 + T細胞は、その後、通常は感染6の10日間以内に、募集し、ホストからのリステリアの最終的なクリアランスを担当しています。 感染マウスからのリステリアの成功クリアランスは、宿主の免疫応答6の適切な発現に依存する。近交系マウス系統7,8の間で感度の広い範囲があります。一般に、 リステリア感染症にかかりやすくなることでマウスは抵抗性マウスに比べて増加細菌負荷および/ ​​または遅延クリアランスを示す、細菌の増殖を制御するために以下のことができます。連鎖解析とノックアウトマウス系統を含む遺伝学的研究は、配列の変化がリステリア感染6,8-14する宿主応答に影響を与えるための種々の遺伝子を同定した。異なるマウス系統間に感染動態の定量と比較すると、したがって、 リステリア菌に対する免疫応答に寄与する宿主遺伝要因を同定するための重要な方法です。別のリステリア菌に対する宿主応答の比較はまた、抗生物質療法やワクチンの設計のための潜在的なターゲットとして働くことができる細菌の病原性因子を同定するための効果的な方法です。 ここでは、細菌負荷（コロニー形成単位[CFU]あたりの組織）を測定し、 リステリア感染マウスにおける免疫応答のFACS分析のために肝臓や脾臓の単細胞懸濁液を調製するための簡単な方法を説明します。このメソッドは、最初の小説のマウス系統におけるリステリア感染の特性だけでなく、 リステリアに感染した別のマウスの系統間の免疫応答の比較のために特に有用である。私たちは、 リステリア菌を使用し、血液寒天培地上で培養したときに、ひずみ15 EGDβ-溶血1（図1）による各コロニーの周り特性ハローゾーンを示す。細菌負荷と免疫応答は、以下に記載されているプロトコルを使用してFACS解析のための血液寒天プレートと準備組織の細胞懸濁液での培養組織ホモジネートによる感染後の任意の時間の時点で決定することができます。我々は、免疫不全または妊娠している個人がリステリア菌処理ではないことに注意してだ、と仕事が始まる前に、関連する制度的なバイオセーフティ委員会及び動物施設の管理に相談する必要があります。

リステリア菌は、マウスの細胞内細菌に対する免疫応答と遺伝的感受性を研究するためのモデル生物です。このメソッドは、細菌の負荷を測定し、 リステリア感染による免疫細胞の変化を決定するためにFACS解析forマウスからの肝臓と脾臓の単細胞懸濁液を生成するものを可能にします。

Listeria monocytogenes (リステリア) は、グラム陽性の条件的細胞内寄生病原体である1。マウスを用いた研究では、通常、...の静脈内注射が用いられる。

このビデオでは、マウスの肝臓および脾臓から細菌負荷量を測定し、単一細胞懸濁液を作製および解析する方法を実演します。まず、リステリア接種液を調製し、マウスに静脈内注射します。その後、設定したタイムポイントで安楽死させたマウスから血液、肝臓、および脾臓を採取します。採取した組織および馬血 agar プレートで培養した組織ホモジネートから、単一細胞懸濁液を調製します。得られた細胞懸濁液は、フローサイトメトリー分析によって生存率および免疫細胞含有量を解析でき、同時に細菌負荷量はコロニー形成単位に基づいて決定されます。この手法は、感染臓器内の細菌負荷量を決定すると同時に、感受性株と耐性株の間などのステロイド感染に対する免疫応答の特性解析に役立ちます。まず、リステリア菌接種液を目的の濃度に調製します。リステリア菌の培養、保存、および調製に関する手順は、付属の書面プロトコルを参照してください。接種液が準備できたら、100 µLずつ2つの分注量を、900 µLのPBSを含む滅菌マイクロチューブに移して10倍希釈を行います。次に、各希釈液から100 µLを馬血寒天（HBA）プレートに移し、滅菌スプレッダーで十分に塗展してコロニー形成単位（CFU）を計測します。その後、プレートを倒置して37 °Cで一晩インキュベートします。続いて、マウスを清潔なケージに移します。尾静脈を拡張させるため、ケージを250 wattの赤外線ランプの下50 centimetersの位置に5分間置きます。これにより、注射時の視認性が向上します。ここでは、リステリア耐性マウス系統であるC 57 black sixと、リステリア感受性マウス系統であるBalb/cに注射を行います。チューブを数回反転させ、リステリア懸濁液を穏やかに混合してください。次に、1 mLシリンジに27Gの針を装着し、マウス1匹あたり 200 µL を注射できるよう充填します。注射前に、シリンジ内の気泡を完全に除去してください。マウスを保定装置に固定します。次に、まず尾部背面の中央にある尾動脈を確認し、マウスの側尾静脈を特定します。その後、尾をわずかに側方へ回して静脈を確認します。70%エタノール綿で尾を優しく拭き、シリンジを引き抜いた後に注入します。滅菌ガーゼで穿刺部位を軽く圧迫します。黒色のマウスでは、注射後に尾静脈を識別するのが非常に困難になることに注意してください。プレート上のすべてのマウスに注射した後、マウスをケージに戻し、残りの接種液をコロニー形成単位（CFU）算出のために培養します。前日と同様に、翌日にコロニー数をカウントし、リステリア接種液の接種前および接種後の濃度を決定します。ここに示されているように、個々のコロニーの周囲に見られる特徴的なハローは、β溶血によるものです。接種前後のカウントが完了したら、接種前後のコロニー形成単位（CFU）数を合算し、それを2で割ることで平均コロニー形成単位を算出します。最後に、投与後のさまざまな時間経過において、安楽死させたマウスから血液を採取し、肝臓と脾臓を摘出します。FAX解析を行う場合は、血液を除去するために摘出前に肝臓を灌流させる必要があります。安楽死直後に心臓採血を行い、適切な採血チューブに可能な限り多くの血液を回収してください。肝臓を灌流させるには、まず腹腔を開き、胆嚢を取り除いて廃棄します。後大静脈は脊椎に並行して走行する静脈であり、肝臓を含む身体の下部から心臓へと血液を輸送します。はさみを使用して、心臓の直下で静脈を切断し、灌流液が排出される出口を作ります。次に、肝葉を頭側へ反転させ、腸管を右側に押しやって、肝臓の下部へと流入する肝門脈を露出させます。右下側から、曲げた長さ1/2インチの26ゲージ針を門脈に挿入し、10 millilitersのPBSを注入します。1から2 millilitersのPBSを注入すると、肝臓の色が暗赤色から淡褐色に変化します。注入された溶液は、切断された下大静脈から流出します。肝灌流を行うことで、回収された細胞が循環血液ではなく肝臓由来であることを保証します。次に、灌流させた肝臓をマウスの体腔から取り出し、氷上のfactsバッファーが入ったチューブに浸します。続いて脾臓を取り出し、次節で述べる方法と同様に処理するため、氷上に置きます。肝臓から単一肝細胞懸濁液を作製するには、まず灌流後の肝臓をfactsバッファーから、60mmペトリ皿に設置した70µmセルストレーナーへと移します。5 Lのシリンジプランジャーを使用して、組織をセルストレーナー経由でペトリ皿に押し出します。単一細胞懸濁液を50 mLの円錐形スクリューキャップチューブに移し、冷えた FACS バッファーで全量を40 mLにします。細胞懸濁液をボルテックスします。次に、細菌量の測定用に1 mL分を分注して取り分けておきます。後の工程で、50 mLチューブを遠心分離機にかけ、4 °Cで500 ×g、5分間遠心して細胞をペレット化します。上清を捨てた後、ペレットを40 mLの冷温fax bufferで再懸濁して遠心分離し、この洗浄工程を繰り返します。再び、ペレットを室温で20 mLの等張per holeに再懸濁し、細胞懸濁液を室温で700 ×gで12分間遠心分離します。遠心分離後、肝細胞がペロールの上にディスク状の層となって浮遊し、白血球がチューブの底に再ペレット化します。肝細胞層とペロールを廃棄容器に注いで除去してください。次に、白血球を含むペレットを4 mLのTACバッファーに再懸濁して赤血球を溶血させ、チューブを頻繁に転倒させながら室温で最大10分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞懸濁液を100 µmのナイロンメンブレンでろ過し、新しい10 mL遠心チューブに回収します。ここに示すように、ろ過した細胞懸濁液の下層に1 mLのFACS EDTA緩衝液を加えます。次に、4 °Cで350 ×gにて5分間遠心分離します。遠心後、5 mLのFACS EDTA緩衝液で再懸濁し、再度遠心分離を行い、ペレットの大きさに応じて0.5～3 mLのFACS EDTA緩衝液でペレットを再懸濁します。トリパンブルー排除法に基づき、ヘモサイトメーターを用いて生存肝白血球数を測定します。その後、単一細胞懸濁液を目的の細胞表面マーカーに特異的な抗体で標識し、FACSで解析することができます。肝臓および脾臓組織から単一細胞懸濁液を作製した後、手順の一部として細菌負荷量を測定します。組織のホモジナイズにはストマッカーを用い、漏出を防ぐためストマッカー用バッグをしっかりと閉じて操作します。まず、クリーンベンチの上に平らに置きます。太い丸ペンのようなもので、バッグ内の組織がすりつぶされるまで組織の上を転がします。組織をすりつぶした各胃の採取バッグに、5 mLのPBSを加えます。胃またはバッグをストマッカーに入れ、高速で10分間運転します。ストマッカーは2つのパドルで胃またはバッグを指定の速度で圧迫し、内容物を均一なホモジネートに混合させ、エアロゾルの飛散を防ぎます。ピペットを用いて、バッグ内のホモジネートを混合します。その後、300 µLを96ウェル平底プレートに2連で分注します。96ウェルプレートのウェル内で、10⁻⁵希釈まで10倍段階希釈を行います。各組織ホモジネート試料について、滅菌スプレッダーを用いて、各希釈液0.1 millilitersをあらかじめ乾燥させたHBAプレート上に慎重に塗布します。プレートを37 degrees Celsiusで一晩インキュベートします。翌日、各希釈段階におけるコロニー形成単位（CFU）数をカウントし、組織の分取量、希釈倍率、およびホモジネートの液量を考慮して、組織あたりのコロニー形成単位を算出します。C57BL/6マウスに約2000 CFUのリステリアを感染させ、感染後3日および7日にマウスを安楽死させ、肝臓を灌流した後、脾臓と共に採取しました。脾臓ホモジネートまたは肝単一細胞懸濁液を希釈し、HBAプレートで培養して細菌量を測定しました。ここに示した結果において、点線は臓器あたり 100 colony forming units の検出限界を示しています。リステリア菌量は、7日目よりも3日目の方が多くなっていることに注目してください。これは、7日目までに様々な免疫細胞によってリステリア菌が除去されるためです。これらの2つの組織（脾臓および肝臓）において、単一細胞懸濁液をトリパンブルーで染色し、血球計数器にロードしました。赤枠で示された計数領域内の細胞をカウントします。死細胞はトリパンブルーを取り込んで青く染まりますが、生存細胞は染まりません。ここに示すように、左側の脾臓における生存細胞数と右側の肝臓における生存白血球数は、感染の経過に伴い増加します。この増加は、活性化し増殖してこれら2つの感染部位へと遊走する好中球やリンパ球を含む免疫細胞によるものです。リステリア感染経過中の免疫細胞レベルの例として、代表的なfaxプロットとCD8陽性T細胞数にここを示します。CD8陽性T細胞数は、感染後2〜3日目に脾臓でのリンパ球減少により一時的に減少しますが、5日目からは脾臓と肝臓の両方で著しく増加します。この手順に続き、アンドロゲンの変動、抗原特異的T細胞の解析、およびソートした免疫細胞の機能アッセイなどの他の手法を用いることで、リステリア感染に対する免疫応答をさらに詳細に特性解析することが可能です。

measuring-bacterial-load-immune-responses-mice-infected-with-listeria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Lo, B. C. ほか慢性サルモネラ感染による腸線維症。 J. Vis. Exp.

慢性腸感染症のマウスモデルにおける組織細菌負荷の定量化

出典: McMullen, P. D., Freitag, N. E. 『リ ステリア・モノサイトゲネスを用いた感染マウスにおける心細胞の細菌侵入と心臓定着の評価』。 J. Vis. Exp. (2015年)この動画では、マウスの尾にリ ステリア・モノサイトゲネス...

リステリア・モノサイトゲネスの尾静脈注射後のマウス心臓における細菌負荷の定量化

Source: Ahn, J. J., et al. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates bacterial load measurement in spleen and liver tissues isolated from mice infected with an intracellular bacterial pathogen. Bacteria, accumulated within tissue-resident phagocytes during systemic infection, are released using detergent-based lysis and mechanical disruption. Serial dilutions of the homogenates are plated on...

Quantification of Bacterial Load in Mouse Spleen and Liver After Systemic Infection

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

このビデオは、リステリア菌に感染した灌流マウスの脳からの感染性細菌負荷の定量化を示しています。...

リステリア菌感染後のマウス脳における細菌コロニー形成の評価

本稿で使用して、マウスの経口感染のための新規な方法を説明します...

の口頭伝達<em&gt;リステリア菌</em&gt;汚染された食品の摂取を介したマウスにおける

リステリア単球遺伝子は、妊婦の胎児感染を引き起こし、感受性のある集団では髄膜炎を引き起こす。 細菌の亜集団は心臓組織を植民地化し、患者および実験動物に心筋炎を引き起こす可能性がある。...

リステリア単球遺伝子を用いた感染マウスにおける培養および心臓コロニー形成における心臓細胞の細菌浸潤の評価

このプロトコルは、 リステリア・モノサイトゲネスのEGD株と（リステリア菌）を C57BL / 6Jマウスに接種すると、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT（NKT）細胞によるインターフェロンγ（IFN-γ）反応を測定する方法を説明しますそして、適応Tは、感染後のリンパ球。このプロトコルは、病原体の改変されたLD 50用量での感染後のマウスの生存の研究を実施する方法について説明します。...

と実験感染<em&gt;リステリア菌</em&gt;ホストインターフェロンγ応答を研究するためのモデルとして、

感染中にリステリア菌は脳を植民地化する血液-脳関門を通過することができます。このプロトコルではマウスの感染臓器の細菌の植民地化を評価する方法を示します。脳実質の細菌数の定量法の全臓器灌流を実行する手順を提供しています。...

リステリア菌脳の感染症

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

ここで生体内でワクチンの評価のためのエレガントなプロトコルの有効性と宿主免疫応答を提示します。このプロトコルは、ウイルス、細菌、ワクチンのモデルまたは寄生病原体に対する適応ことができます。...

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

学ぶリステリア感染マウスの細菌負荷測定と肝臓・脾臓からの単細胞懸濁液調製法。FACS解析による免疫応答評価と感受性・抵抗性マウス系統間の比較が可能です。

に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌

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