Immuno-RNA Fluorescence In Situ ハイブリダイゼーションを使用した SARS-CoV-2 の可視化

固定および透過処理されたコロナウイルス感染のベロ細胞(インターフェロン欠損哺乳類細胞株)を取ります。

宿主内では、ウイルスRNAはサブゲノムまたはsgRNAとして存在し、転写を介して合成された特定のウイルスタンパク質をコードする中間長のRNA分子です。

ハイブリダイゼーション連鎖反応またはHCRイニシエータープローブを追加します。

HCRプローブは、標的RNA上の相補配列に結合します。

蛍光標識オリゴヌクレオチドヘアピンプローブ、H-1およびH-2を導入します。

イニシエータープローブは、相補的なH1テールに結合し、ヘアピン構造を線形化します。

露出したH1配列は、その相補的なH2テールに結合します。

後続のH2配列はH1テールに結合し続け、標的領域の周囲で蛍光タグ付きプローブを増幅し、堅牢なシグナルを生成します。

適切な抗体を追加して、宿主細胞の細胞骨格を視覚化します。

DAPIを使用して核を染色します。

蛍光顕微鏡下では、ウイルスに感染した細胞は細胞質に赤色の蛍光を示し、標的RNAの存在を示します。

テキスト原稿に記載されているように、細胞を固定および透過処理した後、ウェルから1x PBS溶液を取り出し、各ウェルに少なくとも300マイクロリットルの増幅バッファーを追加します。サンプルを室温で30分間インキュベートします。各HCRヘアピンを別々のチューブで必要な容量のスナップ冷却して準備します。

300マイクロリットルの増幅液を調製するには、各ヘアピンの18ピカモールを使用します。ヘアピン溶液をチューブに移し、摂氏95度で90秒間インキュベートします。その後、暗所で室温まで30分間冷やします。スナップ冷却したH1およびH2ヘアピンを増幅バッファーに加えて、ヘアピン混合物を調製します。30〜50マイクロリットルのヘアピン混合物をパラフィルムに滴下し、サンプルを室温で暗所で一晩インキュベートします。

スライドを取り付けるには、10マイクロリットルの封入剤をスライドに2滴垂らし、1枚のスライドに2つのカバーガラスを置くことができるように滴が十分に分離されていることを確認します。カバーガラスを清潔なタオルで軽くたたいて、余分な液体を取り除きます。次に、セルを下に向けて色あせ防止封入剤に入れます。取り付けられたサンプルを暗所の乾燥した平らな面に置き、硬化させます。