JoVE 実験百科事典
免疫学
0 回視聴 • 3:42 分 • July 8th, 2025
イネの苗から切り取った均一な鞘セグメントとイネの葉から得られた葉の円盤を含むマイクロプレートを取ります。
滅菌水を加え、一晩インキュベートして、創傷ストレスから回復させます。
病原体関連分子パターンまたはPAMPとして作用する細菌のべん毛に由来する免疫原性ペプチドを追加します。
切断端の植物細胞は、パターン認識受容体を介してPAMPに結合します。
この結合は下流のシグナル伝達を引き起こし、呼吸バーストオキシダーゼホモログまたはRBOHと呼ばれる原形質膜に局在する酵素を活性化します。
活性化されたRBOHは、アポプラスト(細胞間空間)で活性酸素種またはROSを生成します。生成されたROSは過酸化水素に変換されます。
ペルオキシダーゼ酵素と化学発光基質を加えます。
ペルオキシダーゼは、過酸化水素を利用して基質を興奮状態の中間体に変換し、エネルギーを光として放出し、基底状態に戻ります。
両方の組織タイプの発光を測定して、PAMP処理直後の急激な増加を検出し、ROSバーストを示します。
ROSアッセイの前日に、生後10日の稲の苗から鞘を鋭利なカミソリの刃または外科用刃で3mmのセグメントに切り、前処理を行います。100マイクロリットルの二重蒸留水を含む96ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに5つのシースセグメントを10〜12時間置きます。
プランジャー付きの生検パンチを使用して、生後4〜6週間のイネから葉の円盤を切り取ります。データのばらつきを減らすために、常にメイン耕うん機の2番目の葉の中央の3分の1からリーフディスクをカットします。次に、100マイクロリットルの二重蒸留水を含む96ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルに1つのリーフディスクを10〜12時間前処理します。葉側に関連する変動を避けるために、水の前処理のために、すべての葉のディスクをマイクロタイタープレートのウェルに浮かせて上を向いたままにしてください。
9.4mlの50マイクロモルトリス-HCl、400マイクロリットルのL-012溶液、100マイクロリットルの西洋わさびペルオキシダーゼ、および100マイクロリットルのflg22を組み合わせて誘発溶液を調製します。200マイクロリットルの誘発溶液をウェルに加えます。
ソフトウェアを起動し、[実験]ボタンをクリックして、新しいプロトコルを作成するか、既存のプロトコルを使用します。ポップアップの[手順]をクリックしてプレートをセットアップし、モニターするウェルをプレートから選択します。[キネティックの開始] をクリックし、実験の要件に応じて、実行時間を 30 分以上に設定します。最小間隔を選択して、できるだけ頻繁に読み取り値を取得し、積分時間として、信号強度に応じて1秒以上を選択します。
「検証」をクリックし、「OK」をクリックして設定を確認します。次に、ポップアップで[新しいプレートを検出]をクリックし、ソフトウェアがロードプレートダイアログボックスを表示するのを待ちます。組織の損傷や乾燥を避け、前処理された組織を含むウェルから二重蒸留水を慎重に取り除きます。マルチチャンネルピペットを使用して、200マイクロリットルの誘発溶液を組織を含むウェルに追加します。テストするプレートをキャリアに置き、検出を開始します。