ラット間膜の血管新生アッセイ

スウェーデンのグッテンブルグにあるGaN大学病院病理学教室へようこそ。私はクラウス・ノルビー博士です。これからご紹介する手法は私の研究室で開発されました。低酸素状態、固形腫瘍、またはその他の血管新生疾患に伴って起こる臨床的に重要な血管新生は、ほぼ例外なく元から血管が存在する組織内で発生します。成体の小型げっ歯類において、小腸を体壁の後面に接続している腸間膜には、薄い膜状の部分が数多く存在します。ラットの場合、これらの腸間膜窓は40から50個ほどあります。これらは肉眼で見ると実質的に透明であり、窓のような形態をしており、成体雄ラットでは各窓が脂肪組織に囲まれています。

腸間膜窓は元来血管が分布していますが、測定可能な生理的血管新生は認められません。そのため、成体の元来血管分布を持つ哺乳類組織におけるde novo血管新生を研究する機会を提供します。つまり、すべての正常組織と同様に、テスト組織内で内因的に作用している血管新生抑制因子を克服し、ゼロから完全な血管新生反応を開始させることです。マウスの場合、多くの窓において親微小血管として機能し得る元来の微小血管が存在せず、残念ながらそのままの状態ではアッセイの結果に予測不能な変動が生じます。

ラットの腸間膜窓には、通常、成体ラットの辺縁部に位置する比較的少数の細小血管が含まれています。これらの腸間膜窓は、本来の厚さがわずか 5 から 10 µm です。これにより、損傷のない組織をスライドグラス上に広げて顕微鏡で観察することができ、その結果、各窓内のすべての血管を観察することが可能となり、実質的に血管を二次元的に展開して捉えることができます。

この手法は、血中の微小血管の空間的広がり、密度、パターン形成、およびサイズを定量的に測定するための比類のない機会を提供します。皮下部位は血管新生研究に広く用いられていますが、内皮細胞の不均一性や組織特異的な特性があるため、血管新生の制御や皮下組織、および皮下で増殖する腫瘍における血管新生の制御が、肺、肝臓、骨、脳などの内臓器官における血管新生や転移の制御を必ずしも予測できるとは限りません。内臓転移が最終的にがんの致死性の原因となることが一般的であるため、この点は注目に値します。

腸間膜ウィンドウが内臓であるという事実は、この点において有利であると考えられます。本プロジェクトの目的は、de novo血管新生の諸側面を定量的に研究することです。そのため、確立された血管新生促進因子または試験物質を腹腔内に注入します。

通常、非麻酔下の成体ラットに一度に5 mLを注射します。この量であれば、腸間膜全体を速やかに注入液にさらすことができます。腹腔内に注射される溶液は、その量が極端に少なくない限り、試験組織内のすべての細胞に影響を及ぼします。特に、極めて薄い腸間膜ウィンドウを覆う中皮細胞層は溶質に対して透過性が高いためです。また、手術を伴わないため、腸間膜ウィンドウで観察される血管新生は、創傷治癒に伴う血管新生の影響を受けません。したがって、血管新生治療は腹腔内注射の形式で行われます。

実用上の理由から、VEGF 165、164、およびbasic FGFなどの特定のタンパク質の血管新生作用を研究する際の標準的な手法として、月曜日の朝から金曜日の朝までの5日間、1日2回の注射を行う投与プロトコルを用います。通常、溶媒にはPharmacia輸液溶液を使用します。投与回数が多く見えるかもしれませんが、VEGFやbasic FGFのような強力な血管新生促進因子であっても、生理学的レベルに近い量で単回投与または数回の間隔を空けた投与を行った場合、統計的に有意な血管新生を誘導できるとは限らないことが示されています。これは、組織内で強力な内因性血管新生抑制因子が作用していることを考慮する必要があるためです。

血管新生調節治療法の投与は、臨床的な治療状況を模倣しています。1つまたは複数の血管新生調節因子を、全身投与、皮下投与、静脈内投与、または経口投与することが可能です。例を挙げます。

これは、親化合物だけでなくその代謝物の影響も研究できるという点で、臨床治療状況を模倣しています。このシステムにより、全身投与された血管新生調節剤の毒性影響をある程度制御することが可能になります。成体ラットは生理的に成長し、2〜3週間の実験期間中に体重が約40%増加することがあるため、動物の体重を測定することで、治療が体重増加をどの程度抑制したかを把握することができ、これを毒性影響の指標とすることが可能です。

これにより、血管新生調節試験において避けるべき毒性量での投与が可能になります。毒性影響が関与している場合、結果を特異的な抗血管新生作用として解釈することが不可能になる可能性があるため、これは重要な利点となります。成体ラットは成体マウスよりもかなり速く成長するため、毒性物質が体重増加に及ぼす影響は、マウスよりもラットにおいて全身性の毒性影響のより感度の高い指標となるはずです。

次に、腸間膜ウィンドウ標本の作製方法について説明します。これらの動物はCO2を用いて安楽死させました。腸間膜ウィンドウは、腸間膜の遠位側から順に、3×1インチの通常のプラススライドガラス上に広げます。

回盲弁から逆行方向に移動しながら、腸間膜ウィンドウにおける血管新生を目視で確認できない範囲を特定します。腸間膜の最も遠位部から採取した4つのウィンドウを使用します。スライド上の検体を室温で20分間乾燥させます。

腸管の断端を切り離します。その後、検体を-20°Cのフリーザーで保存します。これにより、品質に著しい低下をきたすことなく、数ヶ月、場合によっては数年間にわたって検体を保存することが可能です。

ラット内皮に対するモノクローナル抗体を用いて染色を行います。検体を自然乾燥させ、カバーガラスで封入しないでください。個々の腸間膜窓における血管の発生頻度の定量化は、総合光学倍率14倍から34倍の描画顕微鏡を用いたコンピュータ支援形態計測顕微鏡法により行います。腸間膜窓全体を可視化します。

標本が視野の可能な限り広い範囲をカバーするように、拡大倍率は固定ステップで選択します。ウィンドウと周囲の脂肪組織との境界が明確であるため、ウィンドウの全領域を容易に描写できます。その後、慎重に定義された基準に従って、すべての血管化部分を描画します。

高倍率で観察した際に直径が約 2.5 to 3.0 micrometers であることが判明した、ごく小さな新生血管であっても、明確に識別することが可能です。ラット赤血球の平均直径が 6.3 micrometers 以上であるという事実は、これらの血管がいかに小さいかを示しています。ウィンドウ全体の面積に対する、血管が存在するすべての部位の面積の割合を、相対血管面積 va と呼びます。

これは実質的に血管の空間的な広がりを測定するものであり、血管は本質的に二次元的な広がりを持つため、例えばコンピュータ支援テレメトリを用いてVAを容易に測定できます。次のステップでは、各ウィンドウの血管新生領域における3つの中心部において、微小血管密度とパターン形成を記録します。これらの部位は、80倍の光学倍率で系統的にランダムに選択されます。

描画顕微鏡を用いて、各血管を単一の線として可視化します。各視野の画像はデジタル画像および画像解析装置に転送され、デジタル画像内のすべての血管は幅1ピクセルに細線化されます。その後、装置が血管を表すピクセル数を測定し、視野内の全ピクセル数に対する割合として算出します。

このパーセンテージ数値である微小血管長（MVL）は、血管新生領域の単位面積あたりの微小血管の長さを表しており、微小血管密度の複合的な測定値となります。動物1匹あたり4つのウィンドウのVA平均値に、対応する治療群のMVL平均値を乗じることで、動物1匹あたりの総微小血管長（TMVL）が算出されます。さらに我々は、画像解析を用いて、微小血管の密度と組成を詳細に定量分析する手法を開発しました。

これらには、2つの連続する微小血管間の実際の距離、分岐点、すなわち個々の微小血管の長さ、セグメントLEMS、単位組織体積あたりの微小血管数、セグメント数NOMS、および単位組織体積あたりの微小血管分岐点数NOBPの測定が含まれます。微小血管の屈曲度MVTは、2つの連続する分岐点間の最短距離と実際の距離の差によって算出されます。また、微小血管の交差の発生を示す交差指数INIS、および相互接続ループの形成についても測定されます。ループ形成指数INLFも、微小血管ネットワークの周辺部において同様の手法を用いて正確に測定することが可能です。

また、同一の処理群内の個体間、あるいは同一個体内の異なる腸間膜ウィンドウ間でも大きな差が生じる可能性があるため、試験設計を行うことで、芽の長さ、LESP、および単位組織体積あたりの芽の数（NOSP）を含む芽に関する対応変数を定量化することが可能です。我々は、以下の設計が実用的であることを突き止めました。観察期間中の処理群あたりの動物数は8〜12匹、VAの観点から分析される動物1匹あたりのウィンドウ数、および微小血管長（MVL）、微小血管の長さ（LEMS）、微小血管セグメント数（NOMS）、微小血管数、分岐点数（NOBP）、微小血管屈曲度（MVT）、交差指数（I）、ループ形成指数（INF）の観点から分析されるウィンドウごとの視野数です。コントロールとして、ビヒクルで処理した3匹の動物を使用します。腸間膜ウィンドウ血管新生アッセイは、用量反応研究および血管新生キネティクス解析に適しています。

これは、異なる用量のプロアンギオゲニック因子を動物群に投与し、血管新生反応の異なる時点でこれらの動物を犠牲にすることで実施できます。これにより、拡大期、ピーク、およびその後の血管退行期を定量的な観点から識別することが可能です。この種の研究により、テストしたあらゆる成長因子サイトカインに対するde novo血管新生反応は、速度、効力、および持続時間の面で特異的に用量依存的であることが明らかになっています。

さらに、新しく形成された血管の空間的広がりや微小血管密度におけるパターンは、生理学的用量付近でのVEGFや塩基性FGFによって誘導される血管新生と比較して、多くの場合、明確に用量および時間依存的です。in situでのマスト細胞の選択的活性化により誘導されるマスト細胞介在性血管新生（MCMA）は、かなり高い効力と著しく長い持続時間を特徴としています。実際、客観的な血管新生変数の定量化が可能であること、システムの生物学的関連性が高いこと、および治療の毒性を確認できることから、このアッセイを用いてマスト細胞介在性血管新生が初めて記述されました。

この手法は、構造活性相関および用量反応解析に極めて適しています。ラットMWAAは、生理的な血管新生が欠如しており、かつ手術の影響を受けない、血管が元々存在する成体の内臓組織における血管新生を研究するためのモデルであり、これにより創傷治癒誘発性の血管新生による影響を排除できます。このアッセイは真に定量的なものであり、微小血管の空間的広がり、密度、およびパターン形成を記述する、生物学的に関連のある多くの客観的な変数を正確に評価します。

本アッセイは、血管新生の全身的な影響や調節因子の研究、ならびに構造活性相関および用量反応研究に適しています。ここに記載される手法は、スウェーデンのヨーテボリ大学ヨーテボリ大学病院病理学教室のKloss Carl Norby博士の研究室で開発されました。本プロジェクトにおけるすべての研究は、スウェーデン医学研究評議会（プロジェクト番号 5 9 4 2）の支援を受けています。

プロジェクト開始時から携わったGun Effer氏、Monica Anderson氏（不在）、およびAnn Nemar Lindgren氏による熟練した技術的支援に深く感謝いたします。

この短いプレゼンテーションを通じて、本アッセイの可能性についてご理解いただけたかと思います。もし貴研究室で本アッセイをご利用になり、技術的な問題が発生した場合は、喜んでサポートさせていただきます。また、皆様からのご提案をいただけますと幸いです。

ありがとうございます。