免疫組織化学：ベクターLabsからベクタステインABCキットを用いたパラフィン切片

こんにちは、私はカリフォルニア大学アーバイン校生理学・生物物理学部のChandy研究室の大学院生、Victor Chiです。本日は、Vector Laboratories社のA b, Cキットを用いたパラフィン包埋切片の染色の方法を実演します。この手順では、パラフィン包埋切片の脱パラフィンおよび親水化、抗原を露出させるための熱誘起抗原賦活化、ペルオキシダーゼおよび非特異的タンパク質結合のブロッキング、CD4およびチロシン水酸化酵素および二次抗体でのインキュベーション、そしてスライドの発色と封入を行います。

それでは始めていきましょう。スライドはパラフィン包埋されているため、最初のステップはスライドの脱パラフィンです。これは通常、ドラフトチャンバー内でキシレンを満たした3つの容器を用い、1回5分間の洗浄を3回繰り返すことで行います。

次に、スライドを100%エタノールに入れます。スライド上のワックスが消失していることがわかりますが、キシレンが手袋のゴムを溶かすため、手袋を着用したままスライドを扱わないよう注意してください。その後、100%エタノールに入ったままのスライドを研究室に戻し、親水性勾配処理を行います。

ここでは、スライドに使用する親水化系列について説明します。まず、100%エタノールの液槽2回から開始します。その後、スライドを95%エタノールの液槽2回へと移します。

次に、スライドを70% ethanolの水槽に移し、そこから50% ethanolの水槽に移します。その後、スライドを30% ethanolに移し、2分後に二回蒸留水に移します。二回蒸留水で処理した後、スライドをPBSに浸したままにします。

それでは、キャリッジを用いてスライドを次の浴槽へ移す方法を説明します。まず、キャリッジホルダーを使用してスライドを取り出し、余分な液体を持ち越さないよう、軽く拭い取ります。その後、スライドを浸漬させ、次の濃度変化まで2分間待ちます。

組織を固定すると、抗原が遮蔽されて抗体が結合できなくなることが多々あります。そこで、クエン酸ナトリウムを用いた熱誘起抗原賦活化の方法をご紹介します。それでは、免疫組織化学染色で検出したいCD8抗原の遮蔽を解除するため、電子レンジでの操作に移ります。

ここで溶液を入れ、15分間電子レンジで加熱します。スライドが乾燥しないように、クエン酸ナトリウムとともに15分間沸騰させます。沸騰して液が少なくなった際は、スライドの水分を維持するためにクエン酸ナトリウムを補充しますので、状況を確認しながら行います。

スライドをクエン酸ナトリウム溶液に入れる前に、あらかじめ溶液を45秒間予熱しておきます。次に、スライドをクエン酸ナトリウム溶液に入れ、そのまま15分間加熱します。スライドを入れた状態で加熱すると、通常、沸騰が始まってから約2分から2分半で溶液が沸騰し始めます。

その時点で停止し、失われたクエン酸ナトリウムを新鮮なクエン酸ナトリウムで補充します。クエン酸ナトリウムを15分間沸騰させた後、スライドと溶液を取り出して冷却します。そのためには、スライドホルダーに蓋をして余分な液体を捨て、容器内の溶液が室温まで冷えるまで冷水にさらす方法が最適です。

通常、これには10～15分ほどかかります。シンクからスライドを取り出した後、組織内の内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックする必要があります。そこで、30% 過酸化水素を用いて、1% 過酸化水素溶液を調製します。

ここから、スライドを過酸化水素溶液に直接移します。そして、スライドを過酸化水素中で20分間インキュベートします。20分が経過し、内因性ペルオキシダーゼのブロッキングが完了したら、PBSを用いてスライド上の過酸化水素を洗浄します。

スライドをキャリッジに移し、5分間の洗浄を3回行います。組織が損傷しないよう、スライド同士が接触しないように背中合わせに配置してあります。スライドを慎重に滑らせて、組織がガラスに接触する可能性がないように配置します。

ここで、スライドをPBSに移します。PBSでスライドを洗浄した後、5% BSA、5% goat serum、および 0.1% sodium azide の溶液を用いて、タンパク質の非特異的結合を防ぐためのブロッキングを行います。なお、goat antibodies を使用している場合は、goat serum を別の種の血清に変更してください。

それでは、スライドをスライドホルダーに入れ、溶液を注ぎます。通常は、スライドを入れた際の体積で組織が完全に浸るようになるため、半分まで満たします。コンテナにスライドを入れる際は、組織がコンテナの側壁に触れないように注意してください。

最後のスライドについては、組織が容器に触れないように内側に傾けてください。スライドを一晩ブロッキングしたので、PBSを用いて5分間の洗浄を3回行い、余分なブロッキング溶液を洗い流します。この時点で、抗体の使用量を最小限にするため、液状ブロッキング剤を用いて組織の周囲に円を描きます。

抗体の節約を重視しない場合は、ブロッキング工程で使用したケースのままスライドをインキュベートすることも可能です。ここからは、液状ブロッキング剤を用いて組織の周囲に枠を描く方法を説明します。まず、組織に触れないように注意しながら、余分な液体を取り除きます。

そして、余分な液体を取り除くために角の周りを拭き取ります。ここでも、組織に絶対に触れないよう細心の注意を払ってください。液体ブロッキングピンを使い、ゆっくりと押し下げて流れを作り、そこからペンで組織を囲みます。

液体ブロッキング剤を約15秒間乾燥させます。ここで、一次抗体を添加します。ピペットを使用して、組織全体に一次抗体を掛け、湿度が制御されたボックスに移してください。

キムワイプを使用します。一次抗体でインキュベートしている間にスライドが乾燥するのを防ぐため、このボックスの中にDI waterを湿らせておきます。一次抗体で1時間インキュベートしたので、スライドを取り出し、PBSで余分な抗体を洗い流します。

繰り返し、液体を切り落とし、PBS洗浄液に浸します。同様に、5分間の洗浄を3回行います。3回の5分間洗浄が完了した後、一次抗体と同様の方法で、組織に二次抗体を添加します。

組織を覆うのに十分な量の、二次抗体（ここではヤギ抗ウサギ抗体を使用）を加え、スライドを再び加湿チャンバーに戻します。ABC法を用いる際に不可欠な、ビオチン化ヤギ抗ウサギ二次抗体を使用しています。スライドを加湿チャンバーに移し、1時間インキュベートします。

二次抗体のインキュベーション中に、ABC試薬を調製します。ここでは、Vector Laboratories社のVector Stainキットに含まれるABC試薬を使用します。試薬Aを取り出してプライミングし、15 mLのPBSに3滴滴下します。この際、滴下量は厳密に規定されており、滴のサイズを一定にする必要があるため、チューブを強く絞らないように注意してください。

二次抗体のインキュベーションを約1時間行った後、スライドを取り出し、一次抗体の時と同様にPBSで再度洗浄します。5分間の洗浄を3回繰り返した後、スライドを容器に移し、30～45分前に調製しておいたABC試薬を加えます。容器にABC試薬を加え、スライドが浸るようにして、さらに30～45分間インキュベートします。

スライドをABC溶液に3〜5分間浸したあと、過剰なABC溶液を洗い流します。スライドを取り出し、PBS溶液に入れます。このPBSによる洗浄手順を、1回5分間で計3回繰り返します。

スライドを洗浄している間に、Vector Laboratories社のDABペルオキシダーゼ基質を調製します。pH 7.5緩衝液を取り、2滴加えます。pH 7.5緩衝液に続き、DAB基質反応試薬を取り、それを2滴加えます。

繰り返しになりますが、液滴のサイズが重要であるため、ボトルを絞らずに自然に液滴を落としてください。pH 7.5の緩衝液を2滴加します。次に、DAB基質試薬を4滴、同様に自然に滴下するように加えてください。

最後に、過酸化水素基質試薬を2滴加えてください。これでDAB基質試薬混合液の完成です。これでスライドへの添加準備が整いましたので、スライドを取り出し、PBSを十分に切りさせてください。

時間の経過とともに、DAB試薬はより褐色になります。そのため、このタイミングでスライドに添加します。組織を覆うのに十分な量を量り取り、組織サンプルに直接加えてください。

適切な量を採取し、組織サンプルの上に直接滴下します。時間が経過するにつれて組織サンプルがより褐色に変化し、溶液が反応していきます。DAB溶液を添加した後、この脳切片において、組織がこちらとこちらで褐色に変化しているのが確認できます。褐色に染まったDABは、中脳ドパミン作動性ニューロンを含む領域を示しています。

スライドを2分から10分間現像した後、反応を停止させるために氷冷水に浸します。溶液を切り、スライドを直接氷冷水に入れてください。スライドを氷冷水に浸した後、バスをシンクへ運び、約5分間冷水を流して、バスからすべてのDAB溶液が洗い流されたことを確認してください。

シンクに入れる際は、水流が組織に直接当たらないよう注意し、むしろコーナーのいずれかに当てて、水が溢れ出すようにしてください。そうすることで、水流によって組織が乱されるのを防ぐことができます。洗浄後にスライドを取り出したら、対比染色を行います。では、なぜ対比染色が必要なのでしょうか？

理由の一つは、組織の構造を確認したい場合があるためです。もう一つは、すべての細胞を可視化するためです。したがって、今回の目的では、核を染めるためのヘマトキシリンで対比染色を行います。

スライドを取り出し、過剰な液を除去した後、ヘマチン溶液に1回浸します。その後、スライドを取り出して直接水に入れます。水道水にスライドを入れた後、以前に氷冷水浴で行ったのと同様に、スライドに水を流してください。

ヘマトキシリン洗浄では、ジャーの中の水が澄むまで流水で洗い流してください。対比染色したスライドを水から取り出した後、スライドを再脱水させます。そのため、エタノール系列に逆順で戻していきます。

したがって、脱イオン水で1回、30% ethanolで1回、50% ethanolで1回、70% ethanolで2回、95% ethanolで2回、そして100% ethanolで2回洗浄し、各工程を2分間ずつ行います。スライドを取り出し、余分な液体を拭き取ってから30% ethanolに直接浸し、2分間静置してください。最後の100% ethanol洗浄の後、スライドを再びキシレンに戻します。

再度スライドを取り出し、余分な液体を拭き取ってから、1回目のキシレンに5分間浸します。これで、5分間のキシレン洗浄を3回連続で行うことになります。これで、スライドを封入する準備が整いました。

通常、スライドの準備が整う1分前に、パステアピペットで永久封入剤を吸い上げ、スライドを取り出すまで約1分間放置します。キシレンでの最後の洗浄後、手袋がキシレンに浸かったり濡れたりしないように注意しながら、組織がある面を確認してピンセットでスライドを取り出します。組織に触れないよう注意しながら、キムワイプで余分なキシレンをそっと拭き取ってください。角や端を慎重に拭き、キシレンの大部分を蒸発させます。1枚が乾くまでに、おそらく2枚のスライドまで作業できるでしょう。

一方のスライドの乾燥が終わる頃には、もう一方のスライドが作業可能な状態になっているはずです。完全に乾燥してしまう前に作業を行う必要があります。Perimountを取り、組織に触れないよう注意しながら、組織の横に細い線を引いてください。

カバーガラスを回収し、封入剤を除去します。カバーガラスを45度の角度で当て、ゆっくりと倒します。その後、封入剤がすべての組織を覆うようにカバーガラスをスライドさせます。

次に、それを静かに置き、中心を軽く押して余分な気泡をすべて取り除きます。2つ目の組織を処理している間に乾燥させます。実際には、この段階でスライドを観察するわけではありません。スライドを観察する前に、Permountを一晩乾燥させる必要があります。

そうしないと、顕微鏡の光の下でパーママウントに気泡が生じ、サンプルを台無しにしてしまいます。こちらが、化学物質およびチロシン水酸化酵素に対するウサギポリクローナル抗体で染色した後の脳切片です。ここでも、茶色のDAB染色は中脳ドーパミン作動性ニューロンの位置を示しています。

ヘマチン対比染色は、この組織内のすべての核を青色に染めます。以上で、Vector Laboratories社のABCキットを用いたパラフィン包埋切片の染色の方法について説明しました。今後は、染色する組織の種類や使用する抗体に応じて、条件を調整してください。

それでは、実験の成功をお祈りいたします。