免疫組織化学：ベクターLabsからベクタステインABCキットを用いたパラフィン切片

こんにちは、私はビクター・チーで、カリフォルニア大学アーバイン校の生理学および生物物理学部のチャンディ研究室の大学院生です。今日は、Vector LaboratoriesのA b、Cキットを使用してパラフィン包埋切片を染色する方法を実演します。この手順には、パラフィン包埋切片の脱ワックスと水和、抗原のマスク解除、ペルオキシダーゼ、および非特異的タンパク質結合のブロックのための熱誘起抗原賦活化、CD 4およびチロシンヒドロキシラーゼおよび二次抗体とのインキュベーション、スライドの現像と実装が含まれます。

それでは始めましょう。スライドはパラフィンでコードされているため、最初のステップはスライドを脱ろうすることです。これは通常、ヒュームフード内でキシレンの3つの瓶を使用して、各洗浄に5分間からなる3回の洗浄後に行われます。

次に、スライドを100%エタノールに入れます。スライドのワックスがなくなったことに気付くでしょうが、キシレンが手袋のゴムを溶かすため、手袋をしたままスライドを扱わないように注意してください。そこから、100%エタノールのスライドをラボに持ち帰り、水分補給勾配を受けます。

そこで、ここでは、スライドを通過させる水分補給勾配についてお話しします。それは最初に100パーセントエタノールの2つの浴から始まります。そこから、スライドを95%エタノールからなる2つの浴に移します。

次に、スライドを70%エタノールの1つのバスに移し、そこからスライドを50%エタノールのバスに移します。その後、スライドを30%エタノールに移し、2分後にスライドを二重蒸留水に移します。そして、二重蒸留水で処理すると、スライドをPBSに座らせます。

それでは、スライドを1つのバスから次のコードにキャリッジで運ぶ方法を紹介します。したがって、最初のステップは、キャリッジホルダーを使用し、スライドを取り外し、そっとこすり落として余分な液体を取り除き、次のお風呂に液体を持ちすぎないようにすることです。そこから、それを水に浸し、次のグラデーションの変更まで2分待ちます。

組織が固定されると、抗原がマスクされ、抗体が結合できなくなることが何度もあります。そこで、これから行うことは、クエン酸ナトリウムを使用した熱誘起抗原賦活化の方法を示すことです。さて、今は電子レンジでCD8抗原のマスクを外し、免疫組織化学を使って検出を試みます。

そして、ここで溶液を入れて、15分間電子レンジで加熱します。そこで、クエン酸ナトリウムをスライドで15分間沸騰させて、スライドが乾かないようにします。スライドを見守るので、沸騰したらクエン酸ナトリウムを補充して、スライドが水分補給されたままであることを確認します。

したがって、スライドをクエン酸ナトリウムに入れる前に、溶液を45秒間予温しています。次に、スライドをクエン酸ナトリウムに入れ、クエン酸ナトリウムを15分間加熱しています。スライドが入っていると、通常、溶液は沸騰プロセスの約2〜2分半で沸騰し始めます。

その時点で、私は停止し、失われたクエン酸ナトリウムを新鮮なクエン酸ナトリウムに置き換えます。クエン酸ナトリウムを15分間沸騰させた後、スライドと溶液を取り出して冷却したいと思います。したがって、これを行う最善の方法は、スライドホルダーに蓋をし、余分な液体を注ぎ、瓶内の溶液が室温に冷えるまで冷水の流れに流すことです。

そして、これには通常約10〜15分かかります。したがって、スライドをシンクから取り出した後、組織内の内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックする必要があります。それで、私たちがやろうとしていることは、30%の過酸化水素を利用して過酸化水素の溶液を作り、1%の過酸化水素溶液を作ることです。

ここからは、スライドを直接過酸化水素溶液に移すだけです。次に、スライドを過酸化水素で20分間インキュベートします。さて、20分が経過した後、内因性ペルオキシダーゼをブロックした後、PBSの洗浄を使用してスライドから過酸化水素を洗い流します。

そこで、スライドをキャリッジに移し、5分ずつの3回の洗浄で洗浄します。そのため、これらのスライドは、組織を損傷する可能性のある他のスライドとの接触を避けるために、背中合わせに配置されています。ですから、スライドから滑り落ちて、組織がガラスに接触する可能性がないようにスライドを配置しています。

そこで、スライドをPBSに転送します。そこで、スライドをPBSで洗浄した後、5%BSA 5%ヤギ血清と0.1%アジ化ナトリウムの溶液でタンパク質の非特異的結合のためにスライドをブロックします。ですから、ヤギの抗体を扱っている場合は、ヤギの血清を別の種に変更したい

だから今、私はただスライドを私たちのスライドホルダーに入れて、私たちの解決策でそれを埋めるつもりです。ですから、通常は半分だけ埋めて、スライドのボリュームが組織を水没させることを確認できるようにします。したがって、スライドを容器に入れるときに確認したいことの1つは、これらの組織が容器の側面に触れないようにすることです。

したがって、最後のスライドでは、ティッシュが容器に触れないように内側に回転させます。そこで、スライドを一晩でブロックしたので、PBSで5分間の5回のウォッシュからなる5回のウォッシングで、余分なブロッキング溶液を洗い流します。そこで、この時点では、リキッドブロッカーを使って組織の周りに円を描き、抗体の使用量を最小限に抑えたいと考えています。

抗体の保存に不安がない場合は、ブロッキングステップを行ったのと同じケーシングでスライドをいつでもインキュベートできます。そこで、ここからは、リキッドブロッカーを使って組織の周りに描く方法をご紹介します。そのため、最初に、組織に触れないように注意しながら、余分な液体から血液を取り除きます。

したがって、余分な液体を取り除くために、角を拭くだけです。繰り返しになりますが、組織に触れないように非常に、非常に注意してください。リキッドブロッキングピンを取り、ゆっくりと押し下げて流れを流し、そこからペンでティッシュを囲みます。

リキッドブロッカーを約15秒間乾燥させます。この時点で、一次抗体を追加します。そのため、ピペットを使用して、組織を一次抗体で覆い、湿度管理されたボックスに移してください。

そこで、キムワイプを使用します。ウェドは、スライドが一次抗体とインキュベートするときにスライドが乾燥するのを防ぐために、このボックスにいくつかのdi水と結婚しました。一次抗体を1時間インキュベートしたので、スライドを取り出し、余分な抗体をPBSで洗い流します。

繰り返しになりますが、液体を排出してPBSウォッシュに挿入します。そして再び、5分間3回洗います。ですから、5分間の洗浄を3回行った後、一次抗体を添加したのと同じ方法で、二次抗体を組織に加えます。

ですから、組織を覆うのに十分な量を使い、私たちが使用している二次抗体であるヤギ抗ウサギを追加し、スライドを湿度制御チャンバーに戻します。そこで、ビオチン化ヤギ抗ウサギである二次抗体を使用していますが、これはA BC法を使用する際に不可欠です。そこで、スライドを湿度制御チャンバーに移し、1つのうちをインキュベートします。

そのため、二次抗体がインキュベートされている間に、A BC試薬を調製する必要があります。そこで、ベクターステインキットのベクターラボ、A、B、C試薬を使用しています。だから、試薬を取り出して、それをプライムし、それがPBSの15ミリリットルに3回落とすのを許し、滴は特に計量され、特定のサイズである必要があるため、チューブを絞らないように注意します。

二次抗体のインキュベーションが約1時間終わったら、スライドを取り出して、一次抗体の場合と同様に、再度PBSで洗浄します。そのため、それぞれ5分間の洗浄を3回行った後、スライドをこの容器に移し、30〜45分前に準備したA、B、C試薬を追加します。ここにA、B、C試薬を追加し、スライドを充填して、さらに30〜45分間インキュベートします。

したがって、スライドをa、B、Cに約34〜5分間置いた後、余分なA、B、C溶液を洗い流したいと思います。したがって、スライドを削除してPBSソリューションに追加するだけです。そのため、PBSで同じ洗浄手順を3回、洗濯ごとに5分間繰り返します。

スライドを洗浄している間に、ベクターラボからDABペルオキシダーゼ基質を調製します。pH 7.5の緩衝液を取り、2滴加えます。pH 7.5の緩衝液の後、DAB基質反応試薬を取り、それを2滴加えます。

繰り返しになりますが、液滴のサイズは重要なので、ボトルを絞らずに液滴が落ちるのを待ってください。緩衝液pH 7.5の2滴。そこで、DAB基質試薬を4滴追加して、DAB基質試薬も滴下できるようにしたいとします。

最後に、過酸化水素基質試薬を2滴追加します。これがDAB基質試薬混合物の外観です。これで、スライドに追加したり、スライドを削除したり、PBSがスライドから排出したりする準備が整いました。

そのため、時間が経つにつれて、DAB試薬はより茶色になります。したがって、この時点でスライドに追加したいと思います。したがって、組織を覆うのに十分な量を取り、それを組織サンプルに直接追加します。

したがって、適切な量を取り、組織サンプルの上に直接追加し、組織サンプルが時間の経過とともに茶色くなるはずなので、溶液が発達するのを待ちます。DAB溶液を追加した後、この脳の部分で、こことここで組織が茶色に変わるのを見ることができます。茶色のDABが立っているのは、中脳のドーパミン作動性ニューロンを含む領域を示しています。

2分から10分までどこでもスライドを開発した後、あなたはあなたを追加したいので、反応を停止するために氷冷水にスライドを追加したいと思います。したがって、溶液が排出されるのを待って、スライドを直接氷冷水に加えます。滑り台を氷冷水に浸した後、お風呂を流し台に持って行き、冷水を約5分間流して、このお風呂からすべてのDAB溶液が排出されるようにします。

したがって、シンクを追加するときは、ストリームがティッシュに当たらないように注意し、むしろコーナーの1つにぶつかってオーバーフローさせ、ティッシュが水の流れによって邪魔されないようにします。したがって、スライドを洗浄から取り出した後、カウンターステインをしたいと思います。では、なぜカウンターステインが必要なのでしょうか?

さて、理由の1つは、組織の構造を見たいと思うかもしれないということです。もう一つは、すべての細胞を可視化することです。そこで、私たちの目的のために、核の略であるヘマットトインで汚れを打ち消します。

ですから、スライドを取り、余分な液体を取り除き、ヘマットヘマチン溶液に一度浸すだけでいいのです。1つは、取り出して直接水に加えることです。水道水にスライドを追加した後、以前に氷冷水浴で行ったのと同じように、スライドを水中で実行したいと思います。

したがって、ヘマットトーインウォッシュの場合は、瓶内の水が透明になるまで流水で流します。したがって、カウンターで汚れたスライドを水から取り除いた後、スライドを再脱水したいと思います。そこで、エタノールの勾配に戻したいと思いますが、逆の順序で行います。

つまり、脱イオン水で1回、30%エタノールで1回、50%エタノールで1回、70%エタノールで1回、95%エタノールで1回、2回、100%エタノールでそれぞれ2分ずつ洗浄します。したがって、スライドを取り外し、余分な液体を拭き取り、30%エタノールに直接追加し、2分間放置します。したがって、最後の100%エタノール洗浄後、スライドをキシレンに戻したいと思います。

したがって、スライドを再度取り、余分な液体をこすり落とし、スライドを取り、最初のキシレンに5分間エムを追加します。つまり、キシレンを3回連続して5分間洗浄することになります。そして今、スライドをマウントする準備が整いました。

だから、私が通常行うことは、スライドの準備が整う1分前に、牧草地のピペットを持ってパーママウント溶液を描き、スライドが出てくる準備が整う約1分前にそれを許可しますキシレンの最後の洗浄後、手袋を水没させたり、手袋をキシレンで濡らしたりしないように注意してください。 ピンセットで取り除き、どちら側にティッシュが入っているかに注意してください。キムワイプで余分なXLEをやさしく拭き取り、ティッシュに触れないように注意しながら、角と端を丁寧に拭くだけで、キシレンのほとんどを蒸発させます。おそらく、1つのスライドが乾く前に2つのスライドに取り組むことができます。

したがって、1つのスライドを乾かし終えたら、もう1つのスライドを作業する準備ができているはずです。今、あなたは彼らが完全に乾く前に彼らと一緒に働かなければなりません。そこで、ペリマウントを取り、ティッシュに触れないように注意しながら、ティッシュの横に細い線を引きます。

カバースリップを取ってペリマウントを取り外します。45度の角度で適用し、曲げます。次に、カバースリップをスライドさせて、ペリマウントがすべての組織を覆っていることを確認します。

次に、を敷き、置き、中央をそっと押して余分な気泡をすべて取り除きます。あなたの2番目のティッシュに取り組んでいる間、それを乾かすのを待つことは、実際には私たちのスライドを見る時間ではありません。そのため、スライドを見る前に、パーママウントを一晩乾かす必要があります。

そうしないと、顕微鏡の光の下でパーママウントが泡立ち、サンプルが台無しになります。ここでは、チロシンヒドロキシラーゼに対するウサギポリクローナル抗体を化学物質で染色した後の脳切片を見てみましょう。ここでも、茶色のDAB染色は中脳ドーパミン作動性ニューロンの位置を示しています。

ヘマチン対比染色は、この組織のすべての核を青くします。そこで、Vector LaboratoriesのA BCキットを使用してパラフィン包埋切片を染色する方法を紹介しました。次に、染色する組織の種類と使用する抗体に応じて条件を調整する必要があります。

だから、あなたの実験に頑張ってください。