CXCR4相互作用因子の同定のための細胞アッセイ

CXCR4を発現する付着したヒト脳がん細胞を含むゼラチンコーティングされたマルチウェルプレートを取ります。

培地をカルシウム感受性色素に置き換えます。細胞内エステラーゼは色素を切断して膜不透過性生成物にし、カルシウムイオンに結合し、蛍光の増加を示します。

染料を取り除き、洗浄し、バッファーを加えます。

CXCR4相互作用化合物とケモカインCXCL12含有プレートを含む蛍光マイクロプレートリーダーにプレートを置きます。

設定された自動パラメータを使用して、増加する化合物濃度をテストウェルに注入し、続いて特定のCXCL12濃度を注入します。

化合物のないコントロールウェルでは、CXCL12がCXCR4に結合します。

この結合によりシグナル伝達カスケードが活性化され、カルシウムイオンが細胞質に放出され、そこで色素が結合して蛍光が強まります。

しかし、テストウェルでは、相互作用する化合物がCXCR12へのCXCL4結合を阻害し、カルシウム動員に影響を与え、用量依存的な蛍光低下を引き起こし、それらがCXCR4アンタゴニストであることを確認します。

細胞継代の日に、底が透明な黒壁ポリスチレン96ウェルプレートの各ウェルを100マイクロリットルの0.1%ゼラチン溶液でコーティングし、プレートを室温で2時間インキュベートします。ゼラチンが固化している間に、トリプシン-EDTA溶液を使用して目的の細胞を培養フラスコの底から持ち上げ、細胞が剥がれたら、50ミリリットルのコニカルチューブ内の新鮮な増殖培地に再懸濁します。

カウント後、遠心分離によって細胞を収集し、ペレットを新鮮な増殖培地に再懸濁して、1ミリリットルあたり1 x 10⁵の生細胞濃度にします。プレートの準備ができたら、余分なゼラチン溶液を廃棄し、実験用ティッシュ上でプレートを乾燥させます。次に、ウェルを200マイクロリットルのPBSで洗浄し、ウェルあたり200マイクロリットルの細胞に洗浄を置き換えて、摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。

翌朝、プレートを軽くたたいてウェルから増殖培地を捨て、ペーパータオルでプレートを逆さまに乾かします。次に、ウェルあたり100マイクロリットルのローディング色素溶液で各ウェルの細胞を標識し、プレートを室温で暗所で45分間インキュベートします。細胞がインキュベートしている間に、ウェルあたり75マイクロリットルのCXCL12をケモカインプレートに加え、50マイクロリットルの目的の化合物を化合物プレートの各ウェルに加えます。

次に、蛍光プレートリーダーのクーラーユニットをオンにし、次にプレートリーダー自体の電源を入れます。システムが起動するまで数分待った後、プレートリーダーソフトウェアを開きます。アッセイプロトコルを設定するには、[設定]タブで[読み取りモード]を選択し、ローディング色素に適切な励起波長と発光波長を選択します。

「移送液と混合」タブを選択すると、コンパウンドプレート内の化合物が自動的に混合されます。「移送液」タブで、移送するコンパウンドプレートから測定プレートに各ウェルを20マイクロリットルセットし、ピペットチップを液面下20マイクロリットルに配置します。吸引速度を毎秒50マイクロリットルに、分注速度を毎秒25マイクロリットルに設定し、「転写液で読み取り」をクリックします。

最初のインターバルでは、読み取り間隔時間が1秒の60読み取りを選択し、化合物が測定プレートに分注される前に10の読み取りを記録し、その後に50の読み取りを完了します。2 番目の間隔を 30 秒の読み取り間隔時間と 18 回の読み取りで設定します。プロトコル用に 3 つのチップ洗浄を選択し、各洗浄ステップに適切な洗浄液、1 回の洗浄サイクル、高速ポンプ速度、および洗浄ごとに 5 回のストロークが含まれるように設定します。

「ピペッターの一時停止」機能を使用して、ピペッターの一時停止を 300 秒含み、「移送液と混合」設定を使用して、ケモカインプレート内で CXCL12 溶液を自動的に混合できるようにします。後続の「移送液」タブで、測定プレートに移すケモカインプレートの各ウェルから25マイクロリットルを設定し、チップを液面から20マイクロリットル下に配置します。吸引速度を毎秒50マイクロリットルに、分注速度を毎秒25マイクロリットルに設定します。

「トランスファー液で読み取り」ボタンを使用して、読み取り間隔時間を1秒で145回の読み取りを含むように最初の間隔を設定します。2 番目の間隔を 6 秒の読み取り間隔時間と 20 回の読み取り時間に設定します。さらに3つの洗浄チップサイクルを選択し、「ステージ温度の設定」をクリックして、デバイスの温度を摂氏37度に設定します。

ローディング色素のインキュベーションの最後に、測定プレートからバッファーを廃棄し、ラボティッシュ上でプレートを乾燥させます。アッセイバッファーのウェルあたり150マイクロリットルで細胞を洗浄し、2分後にバッファーを80マイクロリットルのアッセイバッファーと交換します。測定プレートを読み取り位置に、コンパウンドプレートをソース2の位置に、ケモカインプレートをソース3の位置に、黒いチップの箱をソース1の位置に置きます。

デバイスを閉じて「プロトコルシグナルテスト」をクリックして、プレート上の背景相対光単位と蛍光バリアントを決定します。ポップアップウィンドウで「信号」のテストを選択します。8,000〜10,000の相対光単位の背景値が得られた場合は、「更新」を選択し、「保存」をクリックしてメインプロトコルを保存します。