CXCR4相互作用因子の同定のための細胞アッセイ

CXCR4を発現する付着したヒト脳がん細胞を含むゼラチンコーティングされたマルチウェルプレートを取ります。

培地をカルシウム感受性色素に置き換えます。細胞内エステラーゼは色素を切断して膜不透過性生成物にし、カルシウムイオンに結合し、蛍光の増加を示します。

染料を取り除き、洗浄し、バッファーを加えます。

CXCR4相互作用化合物とケモカインCXCL12含有プレートを含む蛍光マイクロプレートリーダーにプレートを置きます。

設定された自動パラメータを使用して、増加する化合物濃度をテストウェルに注入し、続いて特定のCXCL12濃度を注入します。

化合物のないコントロールウェルでは、CXCL12がCXCR4に結合します。

この結合によりシグナル伝達カスケードが活性化され、カルシウムイオンが細胞質に放出され、そこで色素が結合して蛍光が強まります。

しかし、テストウェルでは、相互作用する化合物がCXCR12へのCXCL4結合を阻害し、カルシウム動員に影響を与え、用量依存的な蛍光低下を引き起こし、それらがCXCR4アンタゴニストであることを確認します。

細胞継代の日に、底が透明な黒壁ポリスチレン96ウェルプレートの各ウェルを100マイクロリットルの0.1%ゼラチン溶液でコーティングし、プレートを室温で2時間インキュベートします。ゼラチンが固化している間に、トリプシン-EDTA溶液を使用して目的の細胞を培養フラスコの底から持ち上げ、細胞が剥がれたら、50ミリリットルのコニカルチューブ内の新鮮な増殖培地に再懸濁します。

カウント後、遠心分離によって細胞を収集し、ペレットを新鮮な増殖培地に再懸濁して、1ミリリットルあたり1 x 10⁵の生細胞濃度にします。プレートの準備ができたら、余分なゼラチン溶液を廃棄し、実験用ティッシュ上でプレートを乾燥させます。次に、ウェルを200マイクロリットルのPBSで洗浄し、ウェルあたり200マイクロリットルの細胞に洗浄を置き換えて、摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。

翌朝、プレートを軽くたたいてウェルから増殖培地を捨て、ペーパータオルでプレートを逆さまに乾かします。次に、ウェルあたり100マイクロリットルのローディング色素溶液で各ウェルの細胞を標識し、プレートを室温で暗所で45分間インキュベートします。細胞がインキュベートしている間に、ウェルあたり75マイクロリットルのCXCL12をケモカインプレートに加え、50マイクロリットルの目的の化合物を化合物プレートの各ウェルに加えます。

次に、蛍光プレートリーダーのクーラーユニットをオンにし、次にプレートリーダー自体の電源を入れます。システムが起動するまで数分待った後、プレートリーダーソフトウェアを開きます。アッセイプロトコルを設定するには、[設定]タブで[読み取りモード]を選択し、ロ