ウイルス不活化アッセイによる抗ウイルス試験化合物の有効性の評価

換えC型肝炎ウイルス、または分泌されたルシフェラーゼレポーターをコードするRNAを含むHCV懸濁液を含むチューブを採取します。

抗ウイルス試験化合物と溶媒を試験管と陰性対照管に加えます。

試験化合物は HCV 糖タンパク質に結合し、ウイルスを不活性化します。

インキュベーション後、混合物を希釈して、後続のステップでの化合物と細胞の相互作用を防ぎます。

これらの希釈した混合物を、HCV複製をサポートする肝癌単層に加えます。インキュベート。

化合物で不活化されたHCVは特定の細胞表面受容体に結合できませんが、活性HCV糖タンパク質はこれらの受容体に結合し、細胞の付着を促進します。

吸着のHCVを除去し、バッファーで洗浄し、培地を追加します。長時間インキュベートします。

結合したHCVは内在化され、ウイルスRNAを放出し、細胞から分泌されるウイルスタンパク質とルシフェラーゼの合成につながります。

ルシフェラーゼ含有培養上清を採取します。遠心分離し、ルシフェラーゼ基質を上清に加えます。

ルシフェラーゼは基質を酸化し、発光します。

よりもコントロールウェルの発光が高い場合は、化合物によるウイルスの不活性化を示します。

ウイルス不活化アッセイを開始するには、まず、96ウェルプレートのウェルあたり4番目の細胞に10回1回プレートします。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素とともに一晩インキュベートして付着させます。感染の場合は、テキストプロトコルで参照されているように、Gaussia luciferaseレポータータグ付きC型肝炎ウイルスまたはHCV粒子を調製します。

滅菌チューブ内で、100マイクロリットルの100マイクロモルのCHLAまたはPUGを100マイクロリットルの10マイクロリットルをHCVの4番目のフォーカス形成ユニットまたはFFUに混合します。ポジティブコントロールの場合、HCVとヘパリンを1,000マイクログラム/ミリリットルの最終濃度で混合します。摂氏37度で3時間インキュベートします。

3時間後、ウイルス化合物混合物を室温で9.8ミリリットルの基礎培地で50倍に希釈します。次に、新しいウイルス化合物混合物を調製し、この混合物を基礎培地ですぐに希釈し、0時間のインキュベーションサンプル用にします。細胞からインキュベーション培地を除去した後、1ウェルあたり100マイクロリットルの希釈ウイルス薬液を3回ずつ加えます。

には、ウェルあたり10〜2番目のFFUが含まれています。摂氏37度、二酸化炭素5%で3時間インキュベートし、細胞のウイルス感染を可能にします。インキュベーション後、ウェルからウイルス懸濁液を取り出し、200マイクロリットルのPBSで細胞を2回穏やかに洗浄します。

を100マイクロリットルの基礎培地で72時間インキュベートし、ウイルス複製とルシフェラーゼレポーターの上清への放出を行います。次に、培養物から上清をマイクロチューブに集め、17,000 g で摂氏 4 度で 5 分間遠心分離して細胞破片を除去します。各上清20マイクロリットルをガウスルシフェラーゼアッセイ試薬50マイクロリットルと混合し、ルミノメーターでルシフェラーゼレポーター活性からの発光を測定します。