試験薬に対するリンパ腫細胞の感受性における好中球様細胞の役割の解明

リンパ腫細胞、癌性白血球の3Dスフェロイド単培養、およびリンパ腫と好中球様細胞の基底膜マトリックス中の共培養を含むマルチウェルプレートを取ります。

細胞内チューブリンに結合し、微小管重合を妨害し、細胞アポトーシスを引き起こす試験薬を追加します。

共培養では、リンパ腫細胞との直接接触により好中球様細胞が活性化され、サイトカイン分泌が誘導されます。

これらのサイトカインはリンパ腫細胞受容体と相互作用し、下流のシグナル伝達カスケードを引き起こし、抗アポトーシスタンパク質の発現をアップレギュレートして細胞の生存を促進します。

メディアを廃棄します。解離バッファーを添加して、細胞の接着を破壊します。

スフェロイドをこすり落とし、攪拌下でインキュベートします。懸濁液をチューブに移し、撹拌を続けて単一細胞懸濁液を形成します。

リンパ腫および好中球様細胞を標識する蛍光色素結合抗体カクテルを導入します。

蛍光色素タグ付きアネキシンVとヨウ化プロピジウムを添加して、アポトーシス細胞および死細胞を標識します。

フローサイトメトリーを使用して、共培養におけるリンパ腫細胞の生存率の増加を検出し、薬物に対する好中球媒介性保護を示します。

3D共培養を設定するには、50,000個のRLリンパ腫B細胞を単独で追加するか、滅菌15ミリリットルチューブでHL60分化細胞と混合します。

サンプルを回転させ、開口部を2〜3ミリメートルにカットした1ミリリットルのピペットチップを使用して、ペレットを300マイクロリットルの基底膜マトリックスに再懸濁します。次に、24ウェルプレートの各ウェルで300マイクロリットルの細胞を摂氏37度、CO2%で30分間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、1ミリリットルの完全RPMI培地を各ウェルに加え、2日ごとに培地を交換しながら、さらに7日間インキュベーターに3D培養に戻します。5日目に、10ナノモルのビンクリスチンを培養物に加えます。

培養

1週間後、培地を吸引し、1ミリリットルの氷冷PBSで各ウェルを2回洗浄します。次に、EDTAを含む3ミリリットルの氷冷PBSを各ウェルに加え、200マイクロリットルのピペットチップでウェルの底をこすり落とし、ゲルを剥離します。プレートを氷の上で30分間軽く振ってください。次に、細胞懸濁液を個々の滅菌15ミリリットルチューブに移し、氷の上でさらに30分間穏やかに振とうます。

均質な細胞懸濁液の出現を確認します。次に、細胞をスピンダウンし、続いてPBS洗浄を行い、FBSを含む新鮮なPBSにペレットを再懸濁します。最後に、先ほど示したように、適切な抗体と生存率色素で細胞を標識し、図示のゲーティング戦略を使用してフローサイトメトリーによってRLおよびHL60分化細胞を分析します。